三七总皂苷对脊髓损伤大鼠神经元凋亡及Nrf2、caspase-3表达的影响

谢慕可 许念茹 黄贤胜

摘要 目的：探究三七总皂苷（TSPN）对脊髓损伤（SCI）大鼠神经元凋亡及Nrf2、Caspase-3表达的影响。方法：采用“自制击打器”建立SCI大鼠模型，将成功构建的100只SCI大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组及实验组，每组25只。阳性对照组与实验组分别腹腔注射甲基强的松龙[30 mg/（kg·d）]与TSPN[100 mg/（kg·d）]，对照组与模型组则腹腔注射等量生理盐水，连续干预14 d。采用HE染色与TUNEL法检测大鼠脊髓组织病理学变化与神经元凋亡;采用免疫组化法及Wb法检测脊髓组织Nrf2、Caspase-3蛋白表达。结果：与对照组比较，模型组大鼠脊髓组织Nrf2蛋白表达显著降低，且阳性对照组与实验组高于模型组，阳性对照组高于实验组;神经元凋亡率及Caspase-3蛋白表达升高，且阳性对照组与实验组低于模型组，阳性对照组低于实验组（均P<0.05）。结论：TSPN可减轻SCI大鼠脊髓组织病变程度，保护神经元，其作用机制可能与下调脊髓组织Caspase-3蛋白表达，上调Nrf2蛋白表达有关。

关键词 脊髓损伤;三七总皂苷;神经元凋亡;Nrf2;Caspase-3

Abstract Objective：To explore the effects of Panax notoginseng saponins（TSPN）on neuronal apoptosis and expression of Nrf2 and Caspase-3 in rats with spinal cord injury（SCI）.Methods：Rat models were established with the “self-made beater” and 100 successfully constructed SCI rats were randomly divided into a control group，a model group，a positive control group，and a test group，with 25 rats in each group.Positive control group and the test group were given methylprednisolone[30 mg/（kg·d）]and TSPN[100 mg/（kg·d）]by intraperitoneal injection respectively; the control group and the model group were given the same amount of normal saline for 14 d.HE staining and TUNEL method were used to detect the histopathological changes and neuronal apoptosis of rat spinal cord tissue; the protein expression of Nrf2 and Caspase-3 in the spinal cord tissues were detected by immunohistochemistry and Wb method.Results：Compared with the control group，the expression of Nrf2 protein in the spinal cord tissues of rats in the model group significantly decreased，and the positive control group and the test group were higher than the model group，and the positive control group was higher than the test group; and the neuronal apoptosis rate and Caspase-3 protein expression significantly increased，and the positive control group and the test group were lower than the model group，and the positive control group was lower than the test group（all P<0.05）.Conclusion：TSPN can alleviate the degree of spinal cord tissue lesions in SCI rats and protect neurons，and the mechanisms may be related to down-regulation of Caspase-3 protein expression and up-regulation of Nrf2 protein expression in spinal cord tissues.

Keywords Spinal cord injury; Panax notoginseng saponins; Neuronal apoptosis; Nrf2; Caspase-3

脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI）包括原发性和继发性损伤，具有较高的致残率，同时由于目前对其发病机制尚未完全了解，所以仍缺乏有效治療药物[1]。三七总皂苷（TSPN）是三七的主要活性成分，具有抗炎、抗菌及抗氧化等多种药理功效，近年来，其在神经保护方面的研究成为热点。研究发现，TSPN可促进全脑缺血后大鼠脑室下区（SVZ）神经再生，加速SVZ区神经祖细胞增殖和分化，促进星形胶质细胞转化新生未成熟神经元[2]。也有研究报道，黄芪甲苷和TSPN配伍可抑制小鼠脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡，发挥保护神经细胞的作用[3]。目前TSPN在SCI方向的研究尚少，因此开展本研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级、雄性SD大鼠，6～7周龄，体质量200～250 g，购于中山大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2016-0029。饲养环境和条件：饲养于中山大学实验动物中心屏障环境动物实验室，每笼5只，温度（25±2）℃，湿度（55±2）%，光照明暗时间比为12 h/12 h，自由获取食物和水。

1.1.2 药物 TSPN（四川成都麦卡希化工有限公司，生产批号：12052901，纯度≥98%）。

1.1.3 试剂与仪器 甲基强的松龙注射液（大连辉瑞制药有限公司，生产批号：NE0242）;TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，生产批号：180804）;免疫组化试剂盒（PV系列）、DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，生产批号：170910和1170403）;兔抗鼠核因子E2相关因子2（Nrf2）抗体（美国Bio-world公司，生产批号：HM0703）;兔抗鼠天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，生产批号：HS0608）等。RM2235型石蜡切片机（德国Leica公司，型号：GSW-0021）;DM 750型光学显微镜（日本Olympus公司，型号：JMWD-03）;ELX-800酶标仪（美国BIO-TEK公司，型号：KYLS-216）;JY-SCZ2180型垂直电泳槽（西安赛维斯生物科技有限公司，型号：KDY-C23）;Image J图像分析软件（美国NIH公司，型号：BYS-SS161）等。

1.2 方法

1.2.1 实验动物模型制备[4]与分组 将100只SD大鼠随机分为对照组、模型组、阳性对照组及实验组，每组25只。模型组、阳性对照组及实验组均采用“自制击打器”建立大鼠SCI模型，即10%水合氯醛（4 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，摸肋骨定位T10为中心，作长约5 cm的纵行切口，开棘突两侧竖脊肌，暴露T10棘突及椎板，小咬骨钳咬除T10棘突及棘间韧带，咬除黄韧带及椎板，暴露T10段脊髓硬膜，剪开硬膜，暴露脊髓，采用“自制击打器”击打该段脊髓，击打后重物压迫脊髓2 min，建立SCI大鼠损伤模型。术中显微镜下直视受击打段脊髓若出现明显断端，且大鼠脊髓受击打时出现尾部痉挛性摆动，说明造模成功。

1.2.2 干预方法 阳性对照组大鼠腹腔注射甲基强的松龙[30 mg/（kg·d）]，实验组大鼠腹腔注射TSPN[100 mg/（kg·d）]，对照组与模型组则腹腔注射等量生理盐水，连续干预14 d。

1.2.3 苏木精-伊红（HE）[5]染色观察大鼠脊髓组织病理学变化 干预结束后，颈椎脱臼法处死各组大鼠，收集脊髓组织标本。以伤处为中心取1.5 cm脊髓组织，10%多聚甲醛固定，经脱水、包埋、切片等连续制作病理切片，进行常规HE染色，于光学显微镜下观察各组大鼠脊髓组织病理学变化。

1.2.4 TUNEL法[6]检测神经元凋亡情况 脊髓组织采集与病理切片制作同1.2.3。切片加入1% Triton X-100通透液，室温促渗5 min;3%过氧化氢封闭，滴加末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）反应液，37 ℃避光反应1 h;加Streptavidin-HRP 37 ℃避光反应30 min;DAB显色，复染，观察神经元凋亡情况。胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片随机选取4个视野，光学显微镜下计数每个视野中阳性细胞占总细胞的比例，取平均值。凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.5 免疫组化法[7]检测脊髓组织中Nrf2、Caspase-3蛋白的表达情况 取脊髓组织病理切片，免疫组化实验步骤按照试剂盒说明操作。一抗为兔抗鼠Nrf2抗体（1∶100）、兔抗鼠Caspase-3抗体（1∶100），4 ℃过夜;37 ℃复温1 h，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG工作液，37 ℃孵育30 min;DAB显色，中性树胶封片。以细胞质出现棕黄色沉淀物为阳性表达，每张切片随机选择5个视野，光学显微镜下观察并计数其阳性细胞数，求平均值。阳性细胞百分比=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 蛋白免疫印迹（Wb）法[8]检测脊髓组织中Nrf2、Caspase-3蛋白的表达水平 取液氮中保存的脊髓组织，用匀浆机进行匀浆，加入一定量的蛋白裂解液，以12 000 r/min离心5 min，吸取上清液，对所提蛋白进行定量，进行垂直电泳，湿转法转印，一抗4 ℃孵育过夜、隔日滴加二抗孵育20 min，显影，拍照。以β-actin为内参照，采用Image J图像分析软件进行灰度值分析，并计算蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，符合正态分布时，2组之间比较采用Dunnett′s t检验;不符合正态分布时，采用秩和检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠脊髓组织病理学变化 HE染色显示，对照组大鼠脊髓组织形态正常，神经元结构规则;模型组大鼠脊髓组织破坏严重，白质松散不规则，神经元肿胀坏死，并出现炎性反应细胞浸润;阳性对照组和实验组大鼠较模型组损伤轻，神经元形態较完整，炎性细胞浸润少，胶质增生减轻，且阳性对照组病理程度改善优于实验组。见图1。

2.2 各组大鼠神经元凋亡情况 对照组、模型组、阳性对照组及实验组大鼠神经元凋亡率分别为（6.52±3.41）%、（63.11±8.35）%、（21.06±6.24）%、（29.22±5.63）%。与对照组比较，模型组大鼠神经元凋亡率显著升高;与模型组比较，阳性对照组及实验组神经元凋亡率显著降低，且阳性对照组低于实验组（P<0.05）。见图2。

2.3 各组大鼠脊髓组织中Nrf2、Caspase-3蛋白的表达情况 对照组、模型组、阳性对照组及实验组大鼠脊髓中Nrf2蛋白阳性细胞百分比分别为（83.46±6.25）%、（12.52±2.37）%、（56.22±4.96）%、（34.73±4.11）%;Caspase-3蛋白阳性细胞百分比分别为（15.63±2.81）%、（86.87±5.79）%、（38.65±4.54）%、（59.83±3.46）%。与对照组比较，模型组大鼠脊髓组织中Nrf2蛋白阳性细胞百分比显著降低，Caspase-3蛋白阳性细胞百分比显著升高;与模型组比较，阳性对照组及实验组大鼠脊髓中Nrf2蛋白阳性细胞百分比顯著升高，且阳性对照组高于实验组，Caspase-3蛋白阳性细胞百分比显著降低，且阳性对照组低于实验组（P<0.05）。见图3。

2.4 各组大鼠脊髓组织中Nrf2、Caspase-3蛋白的表达水平 对照组、模型组、阳性对照组及实验组大鼠脊髓中Nrf2蛋白相对表达量分别为（0.94±0.04）、（0.12±0.01）、（0.43±0.09）、（0.31±0.12）;Caspase-3蛋白相对表达量分别为（0.16±0.03）、（0.96±0.03）、（0.47±0.07）、（0.59±0.05）。与对照组比较，模型组大鼠脊髓组织中Nrf2蛋白相对表达量显著降低，Caspase-3蛋白相对表达量显著升高;与模型组比较，阳性对照组及实验组大鼠脊髓中Nrf2蛋白相对表达量显著升高，且阳性对照组高于实验组，Caspase-3蛋白相对表达量显著降低，且阳性对照组低于实验组（P<0.05）。见图4。

3 讨论

SCI是一种严重的中枢神经系统损伤疾病，可导致相应躯体运动和感觉功能丧失，造成损伤节段以下肢体严重的功能障碍，虽然目前其具体发病机制尚未完全阐明，但氧化应激损伤与其密切相关[9]。SCI所致的偏瘫、截瘫或肢体痿软等症，其在中医上归属于督脉受损，瘀血阻络，加之患者元气大伤且久卧伤气，多见气虚血瘀之证。TSPN是从三七中提取的多种皂苷活性物质，具有活血祛瘀、通脉活络等功效。研究证实，黄芪甲苷联合TSPN可抑制小鼠脑缺血再灌注早期氧化应激物质的活性，进而减轻氧化应激所致的脑组织中神经损伤，进而保护神经元细胞[10]。本研究结果显示，实验组大鼠神经元细胞凋亡率显著低于模型组，提示TSPN具有保护神经元细胞的作用。

Nrf2是细胞内调节氧化应激反应的保护性转录因子，Nrf2的激活可增强神经元细胞对氧化应激的抵抗能力，进而保护神经功能[11]。Caspase-3是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，是凋亡下游的关键执行者，下调其表达，可抑制神经元细胞凋亡。研究发现，TSPN对6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y神经细胞损伤具有保护作用，其作用可能与激活Nrf2、上调HO-1表达、抑制氧化应激和SH-SY5Y神经细胞凋亡有关[12]。研究显示，TSPN可通过上调B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）和Bax阳性细胞和蛋白水平的比值，减少Caspase-3的活化而抑制全脑缺血后大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡[13]。本研究结果显示，与模型组比较，实验组大鼠脊髓中Nrf2蛋白表达显著升高，Caspase-3蛋白表达降低，提示TSPN可通过上调Nrf2的表达，下调Caspase-3的表达，降低神经元细胞的氧化应激损伤，抑制其凋亡，进而发挥保护神经元细胞的作用，值得临床推广应用。

参考文献

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