十一种香辛料对乳酸菌生长及抑菌性的影响

徐清萍，刘杨，胡丽亚，唐百芬，柳东燕

(1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450001；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450001)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichiacoli)等细菌是引起食源性疾病的主要病原菌[1,2]。细菌污染食品后不但降低了食品的品质和营养价值，还会产生一些令人难以接受的感官性状和毒素。为了抑制因微生物活动引起的食品腐败变质，通常采用添加防腐剂的方式。苯甲酸钠、亚硝酸盐等是常用的传统防腐剂，具有潜在的致癌性、致畸性、环保问题等，因此人们对防腐剂类的食品添加剂在安全性能上提出了更高的要求。乳酸菌是世界公认的食品级安全微生物，其发酵代谢产物可作为食品防腐剂和抗生素替代物来抑制大量致病菌和真菌的生长。乳酸菌能发酵葡萄糖或乳糖产生乳酸，具有调节人体机能、延缓衰老、预防疾病等作用，主要用于制造酸奶、奶酪、泡菜、酸菜、其他发酵食品以及一些保健品[3-5]。乳酸菌在生长代谢过程中产生的各种产物对乳酸菌发酵产品的品质、风味和感官特性具有重要的影响[6]。乳酸菌代谢产生的多种物质还具有抑菌作用，主要包括乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸，CO2、H2O2、胞外多糖、细菌素及其他活性成分[7]。乳酸菌代谢产生的苯乳酸可以有效抑制革兰氏阴性、阳性细菌和真菌的生长[8]。Zhang等[9]发现鼠李糖乳杆菌(LactobacillusrhamnosusLS-8)能产生一种新的小分子抑菌物质 4,6-二甲基-1,2,5-三嗪-3,7-二酮(C6H11N3O2)，该物质仅在酸性条件下具有抑菌活性，可抑制常见的革兰氏阳性和阴性的食源性致病菌。植物乳杆菌(LactobacillusplantarumEM)产生的3-羟基-5-十二碳烯酸(3-hydroxy-5-dodecenoic acid MW 214)对蜡样芽孢杆菌(B.cereus)和烟曲霉(A.fumigatus)有杀菌作用[10]，3-羟基-5-十二碳烯酸和乳酸、乙酸等活性化合物联合使用时能增强抗菌作用。

辣椒、生姜、花椒等香辛料常用于泡菜等食品加工中，具有赋予风味、增进食欲等作用，在泡菜等食品生产中添加香辛料不仅能起到改善风味的作用，还对其中的杂菌具有抑制效果。辣椒、大蒜、花椒、生姜对四川低盐泡菜发酵过程中酵母菌、芽孢菌的生长均具有不同程度的抑制作用[11]。花椒、辣椒、生姜和大蒜的乙醇提取物对马铃薯干腐病菌、番茄灰霉病菌、尖孢镰刀病菌、苹果炭疽病菌、水稻稻瘟病菌和苹果腐烂病菌等真菌具有抑制作用[12]。不同香辛料提取物对不同细菌的抑菌效果不一，八角、丁香、肉桂等香辛料的提取物在浓度50 mg/mL时对金黄色葡萄球菌、假单胞菌等的抑菌效果较好[13]。香辛料中的抑菌成分主要与从香辛料中提取的精油相关，酚类物质是香辛料精油抑菌的主要活性成分[14]。

乳酸菌是泡菜发酵的常见菌株，在发酵泡菜的过程中，对香辛料等原料成分可能具有修饰活性成分结构、产生新的活性物质等作用。研究不同香辛料对乳酸菌发酵的影响，有利于明确香辛料在生产过程中对乳酸菌的生长及抑菌活性的影响，对于泡菜生产中香辛料的选择以及添加比例的确定具有一定的指导意义。通过优化香辛料及乳酸菌组合，对抑制发酵过程中杂菌的生长、延长保质期具有积极意义。

本文主要选择了11种常见香辛料，并对不同香辛料添加对发酵过程中嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌生长及抑菌性能的影响进行了研究，以便于为泡菜、酱腌菜等行业科学合理使用香辛料提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL、大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895：由郑州轻工业大学食品新产品新技术创新实验室提供；金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003：上海鲁微科技有限公司；牛津杯(φ7.8 mm)；白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香叶、芫荽子、辣椒：市售；MRS琼脂、MRS肉汤、营养琼脂、营养肉汤：购自杭州百思生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

TGL-16C型台式离心机 上海安亭科学仪器制造厂；721型可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司；宏诺牌VD-650型净化工作台；3C3A-3型电热培养箱、202-0A型电热恒温干燥箱 沪南电炉烘箱厂；电子数显卡尺。

1.3 香辛料提取液的制备

分别称取白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香叶、芫荽子、辣椒10 g，粉碎，按料液比1∶15加水，煮沸30 min，过滤，分离滤液。将料渣中加水煮沸二次提取，合并两次滤液蒸发浓缩至10 mL，10000 r/min离心10 min。取出上清液，加水定容至10 mL，浓度为1 g/mL，保存备用。

1.4 香辛料对乳酸菌生长的影响

将嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL分别采用MRS斜面培养基活化后，转接入MRS肉汤培养基，32 ℃培养18 h，备用。配制含香辛料浓度为20 mg/L的MRS肉汤培养基，按1%接种量接入活化好的乳酸菌种液，32 ℃培养18 h。培养结束后取5 mL培养液于无菌离心管中，12000 r/min离心10 min，弃去上清液，加入0.9%的无菌生理盐水进行清洗沉淀，并用5 mL无菌生理盐水震荡均匀制成菌悬液，适当稀释菌悬液后，测定菌悬液在600 nm处的吸光度。以直接采用MRS培养基进行培养的乳酸菌为对照，嗜酸乳杆菌LA按照标准曲线N0=14.845A-0.8323，R2=0.9951，乳酸乳球菌按照标准曲线N0=18.248A+3.3125，R2=0.9975计算菌悬液中的菌数。其中，A为乳酸菌菌悬液在600 nm处的吸光度，N0为乳酸菌菌悬液中的乳酸菌数。发酵液中乳酸菌菌数=稀释倍数×N0×106CFU/mL。

1.5 抑菌圈直径的测定

将大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003分别于37 ℃活化，接入肉汤培养基培养18 h后，离心，用生理盐水洗涤，并将菌浓度调整到106CFU/mL，备用。

配制双层平板，将15 mL琼脂(2%)培养基倒入无菌培养皿中，静置，凝固，作为下层。将冷却至50 ℃左右的营养琼脂培养基5 mL倒入已经凝固的下层平板上，作为上层。取0.2 mL大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌悬液涂布平板，涂布均匀。将灭菌牛津杯(φ7.8 mm)均匀放置在培养基上，使其与培养基无缝隙。取200 μL待测液于牛津杯中，37 ℃培养16～18 h，观察抑菌情况，采用游标卡尺测定抑菌圈直径。无抑菌圈为不敏感，抑菌圈直径<10 mm为轻度敏感, 在10～14 mm之间为中度敏感，在15～20 mm之间为高度敏感，>20 mm为极度敏感[15,16]。

2 结果与讨论

2.1 不同香辛料添加对乳酸菌生长的影响

选取白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、八角、香叶、芫荽子、辣椒这11种香辛料，按照20 g/L添加到MRS肉汤培养基中，分别接种嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL，培养24 h后，采用分光光度法测定乳酸菌数。以未加香辛料的MRS培养基培养乳酸菌菌数为对照，考察不同香辛料对乳酸菌生长的影响。其中，总菌数变化率=(香辛料组总菌数-对照组总菌数)/对照组总菌数×100%。

11种香辛料对嗜酸乳杆菌LA生长的影响见图1，其中图1中(1)为添加不同香辛料发酵24 h后总菌数(分光光度法)，图1中(2)为以采用MRS培养基培养24 h后总菌数为对照，添加不同香辛料发酵24 h后总菌数的变化率。

(1)

(2)

由图1可知，添加量为20 g/L时，多数香辛料的添加对嗜酸乳杆菌LA的增殖有一定的抑制作用，其中丁香对嗜酸乳杆菌LA的增殖抑制作用最明显，与对照组相比，总菌数减少23.3%；其次为香叶、辣椒、生姜。肉桂的添加对嗜酸乳杆菌LA的生长具有一定的促进作用。白芷、高良姜、白胡椒、花椒、八角、芫荽子对嗜酸乳杆菌LA的生长影响相对较小，菌数变化在±5%以内。

11种香辛料对乳酸乳球菌LL生长的影响见图2，其中图2中(1)为添加不同香辛料发酵24 h后总菌数(分光光度法)，图2中(2)为以采用MRS培养基培养24 h后总菌数为对照，添加不同香辛料发酵24 h后总菌数的变化率。

(1)

(2)

由图2可知，添加量为20 g/L时，多数香辛料的添加对乳酸乳球菌LL的增殖有一定的抑制作用，其中八角对乳酸乳球菌LL的增殖抑制作用最明显，与对照组相比，总菌数减少9.5%；其次为辣椒。白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、香叶、芫荽子对乳酸乳球菌LL的生长影响相对较小，菌数变化在±4%以内。

由图1和图2可知，不同香辛料对不同乳酸菌生长的影响存在着一定的差异，对于白芷、高良姜、白胡椒、花椒、芫荽子这些常见香辛料来说，在一定浓度范围内，香辛料对乳酸菌的增殖影响不大。

2.2 不同香辛料添加对乳酸菌发酵液抗菌性的影响

抑菌圈实验通常用来作为抗菌剂抑菌活性的筛选，其中抑菌圈直径大于20 mm，极敏感；15～20 mm，高敏感；10～15 mm，中敏感；7～10 mm，不敏感。将香辛料提取液以20 mg/mL添加到MRS液体培养基中，混合均匀，嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL均按1%接种量接种发酵，32 ℃发酵24 h后，测定11种香辛料发酵上清液的抑菌活性，结果见图3和图4。

2.2.1 香辛料对嗜酸乳杆菌发酵液抑菌性的影响

嗜酸乳杆菌LA发酵液及添加不同香辛料时嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895和金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性见图3。

(1)

(2)

其中，抑菌活性改变率C(%)=(D香辛料-D对照)/D对照×100%，D香辛料表示添加香辛料时乳酸菌发酵液的抑菌圈直径，D对照表示未添加香辛料，采用MRS培养基培养乳酸菌时的抑菌圈直径。由图3中(1)可知，嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有抑菌性，不同香辛料的添加对其抑菌活性有一定的影响。由图3中(2)可知，添加高良姜时有利于提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌的抑菌性，其次为生姜。添加辣椒时有利于提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌性，其次为芫荽子、白芷、高良姜、香叶。添加丁香组，嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌的抑菌活性明显降低，应该与丁香对嗜酸乳杆菌的生长有明显抑制作用相关。对比不同香辛料对嗜酸乳杆菌LA发酵液抑菌性的影响，高良姜有利于提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性。同时对同浓度香辛料液的抑菌性进行检测，结果表明同浓度的香辛料液对大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003无抑菌性。表明添加香辛料后抑菌活性通过促进发酵或转化得以提高。将嗜酸乳杆菌LA发酵液的pH调整至7时，测定抑菌活性，则无明显抑菌圈，表明抑菌活性成分主要为有机酸或主要在酸性条件下起抑菌作用。`

2.2.2 不同香辛料对乳酸乳球菌发酵液抑菌性的影响

乳酸乳球菌LL发酵液及添加不同香辛料时乳酸乳球菌LL发酵液对大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7ATCC 43895和金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性见图4。

(1)

(2)

由图4中(1)可知，乳酸乳球菌LL发酵液对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌性，不同香辛料的添加对其抑菌活性有一定的影响。由图4中(2)可知，香叶的添加对乳酸乳球菌LL发酵液对大肠杆菌抑菌活性的提高具有促进作用，花椒的添加有利于提高乳酸乳球菌LL对金黄色葡萄球菌的抑菌性。多数香辛料的添加会降低发酵液对大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895和金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性，对比香辛料对乳酸乳球菌LL生长的影响结果，除个别香辛料对乳酸乳球菌的生长影响较小外，多数香辛料对乳酸乳球菌LL的生长具有抑制作用。香辛料的添加对乳酸乳球菌LL发酵液抑菌活性的降低可能与其对乳酸乳球菌生长的抑制作用有关。将乳酸乳球菌发酵液的pH调整至7时，测定抑菌活性，则无明显抑菌圈，表明乳酸乳球菌LL发酵液的抑菌活性成分主要受pH的影响，其抑菌作用主要在酸性条件下才能发挥。

3 结论

香辛料主要用于各种食品的调味增香等，用于泡菜、酱腌菜等行业，除辣椒、生姜等少数香辛料外，多数香辛料的添加范围低于1%。本文对生姜、高良姜、香叶、花椒等11种常见的香辛料对嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌的生长及发酵液抑菌性的影响进行了研究，结论如下：

不同香辛料对不同乳酸菌的生长影响存在着一定的差异。香辛料使用浓度为20 mg/mL时，丁香对嗜酸乳杆菌LA的增殖抑制作用最明显，其次为香叶、辣椒、生姜；八角对乳酸乳球菌LL的增殖抑制作用最明显，其次为辣椒。其余多数香辛料，白芷、高良姜、白胡椒、花椒、八角、芫荽子的添加对嗜酸乳杆菌LA的生长影响较小，白芷、高良姜、生姜、白胡椒、丁香、肉桂、花椒、香叶、芫荽子对乳酸乳球菌的生长影响相对较小。

浓度为20 mg/mL时，高良姜能明显提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对大肠杆菌的抑菌性，其次为生姜；辣椒能明显提高嗜酸乳杆菌LA发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌性，其次为芫荽子、白芷、高良姜、香叶。丁香则能明显降低嗜酸乳杆菌发酵液对大肠杆菌的抑菌活性。

香叶的添加有利于提高乳酸乳球菌发酵液对大肠杆菌的抑菌活性，花椒的添加有利于提高乳酸乳球菌LL对金黄色葡萄球菌的抑菌性。白芷、高良姜、生姜等多数香辛料的添加会降低发酵液对大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌性。

嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌发酵液对大肠杆菌EscherichiacoliO157:H7 ATCC 43895、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003的抑菌活性成分主要为有机酸或其抑菌活性在酸性条件下起作用。

通过对生姜、高良姜、辣椒、花椒等香辛料对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL生长及抑菌性的研究，表明不同香辛料对不同乳酸菌的生长及抑菌性的影响不同。通过合理组合香辛料及乳酸菌，能更加有效地抑制杂菌，促进安全生产。