猕猴桃自然酒精发酵细菌群落分布状态研究

方月月，解文利，潘肇仪，吴雨桐，周礼红

(贵州大学 生命科学学院，贵阳 550025)

中国传统的发酵食品是中华饮食的重要组成部分，发酵食品就是利用微生物发酵作用所生产的一类食品，发酵食品具有益生菌的特性,如抗菌性,抗氧化性等,可通过微生物的作用将对健康有益的成分传递给食用者[1]。发酵食品中的微生物与健康有密切的联系，因此，揭示不同发酵食品中的微生物群落的分布状态是必要的。郑晓吉[2]利用Illumina-HiSeq测序技术揭示哈萨克族奶酪发酵过程不同成熟阶段微生物群落的演替规律。研究结果表明Lactobacillus和Streptococcus是奶酪微生物群落中的共有细菌属。陈聪聪[3]通过16S rDNA扩增子高通量测序分析对广陈皮样品微生物多样性进行解析，研究结果揭示了细菌类群属于厚壁菌门、蓝细菌门和变形杆菌门。白光剑等[4]应用高通量测序技术分析成品甜芽菜中具有7个细菌门，包括放线菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、厚壁菌门、梭杆菌门。折米娜等[5]利用MiSeq高通量测序技术与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)相结合的手段对酸菜水中细菌多样性研究中的微生物多样性和群落结构进行解析，结果表明酸菜水中的细菌种类较为丰富，其中隶属于硬壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌属(Lactobacillus)为优势属。燕平梅等[6,7]利用DGGE方法研究酱菜中酵母菌多样性，结果表明发酵酱菜中的酵母菌总共有3个属，热带假丝酵母(Candidatropicalis)为优势菌种。利用非培养方法研究榨菜中酵母菌的多样性，结果表明榨菜中有Candidatropicalis,Pichiafermentans,Saturnisporamendonce等酵母菌。

我国拥有很多风味独特的传统发酵食品，发酵体系中的微生物对于发酵食品的生产和风味形成十分关键。目前对于我国一些发酵食品中微生物多样性的认识还十分有限[8]。本文报道了采用可培养方法对猕猴桃自然酒精发酵醪中细菌区系进行多样性研究，研究结果为果蔬发酵食品的品质提高和安全性控制提供了理论基础，为传统发酵食品的生产和开发提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品制备

猕猴桃自然酒精发酵醪(酒精度为16%±1%)：实验室自制。

猕猴桃去杂、去坏果，将猕猴桃用盐水浸泡30 min后去皮，打浆，加入30%的红糖，装瓶，在(25±1) ℃的温度下自然发酵，当酒精度达到16%±1%时进行取样。

1.2 药品与试剂

细菌通用引物(BSF8/20、BSR1541/20)：生工生物工程(上海)股份有限公司合成。细菌DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master Mix、4S green核酸染色剂、DNA Marker-D：购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要设备与仪器

S1000 PCR扩增仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统 美国BIO-RAD公司；ABI 3730XL+全自动DNA测序仪 美国ABI公司

1.4 培养基

西红柿琼脂培养基、西红柿汁琼脂培养基III、BCP培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、MC培养基、MRS培养基、LB培养基I[9-11]。

2 方法

2.1 细菌的分离

取猕猴桃自然酒精发酵醪样品10 g，放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡5 min，充分摇匀，稀释制成10-1菌悬液。将制得的菌悬液梯度稀释[12]。分别吸取浓度梯度为10-3，10-4，10-5的菌液100 μL置于倒好的平板上。将涂布后的平板置于(37±1) ℃静置培养2 d，待培养基表面长出单个菌落，其中根据菌落大小、形态、颜色、表面的粗细、透明圈、粘稠度、高低、边缘的形状、菌块的质地等表型特征挑取单菌落，转接到相应培养基斜面，(37±1) ℃培养2 d，用于菌体制备。

2.2 细菌16S rDNA序列分析

2.2.1 菌体制备

将(37±1) ℃培养2 d备用的细菌斜面菌种用无菌水洗下菌苔，加入到灭菌离心管中，以10000 r/min的速度离心15 s，再将菌体沉淀物用无菌水洗涤2次后用于模板制备。

2.2.2 DNA模版制备

使用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的Solarbio细菌基因组DNA提取试剂盒，按照试剂盒说明书方法进行提取DNA。

2.2.3 16S rDNA PCR扩增

以BSF8/20(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、BSR1541/20(5′-AAGGAGGTGAACCAGCCGCA-3′)为引物，以细菌总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系：DNA模版1 μL，2×Mix 13 μL，10 μmol/L BSF8/20 1 μL，10 μmol/L BSR1541/20 1 μL，ddH2O 9 μL，混匀后进行PCR反应。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，2～4步循环30次，72 ℃延长10 min。

2.2.4 测序方法

DNA测序采用双脱氧链终止法[13]。

2.2.5 序列分析

利用DNAman软件拼接序列，启动Seqman，导入目标序列(峰图文件)，进行数据修正，数据修正后点击Assemble进行拼接，若两个峰图的重叠区域完全匹配，则表明拼接的结果可靠；若两个峰图间有不同碱基，则需要比对两个峰图，选择峰图清晰的作为最终结果。

采用lgBLASTN(1.14.0)程序搜索NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)核酸数据库，下载得分高、序列相似性达到95%以上相关菌株的16S rDNA序列，选择的菌株尽可能来源于保藏机构。采用MEGA 10.0.5软件进行序列比对及聚类分析。

系统发育树构建方法：利用MEGA 10.0.5软件的N-J法重构系统发育树，采用bootstrap检验进行评估，bootstrap检验1000次。在不同种类的细菌菌株中选取代表菌株，采用N-J法将每一类代表菌株序列与GenBank中的模式菌株序列进行分析，构建系统发育树，获得分离菌株的分类地位和系统发育地位(neighbor-joining method，取1000次bootstrap检验)[14-16]。

2.3 α多样性分析

利用R语言(R version 3.5.3 )软件中Spaa包(spaa_0.2.2)和Vegan包(vegan 2.5-4)分析猕猴桃自然酒精发酵醪微生物的α多样性，包括Shannon-Wiener指数、Simpson指数、Inverse Simpson指数、物种累计数(S)、Pielou 均匀度指数(J)。

3 结果与分析

3.1 果蔬自然发酵期间发酵醪中细菌的鉴定

从猕猴桃自然酒精发酵醪中共分离得到49株细菌菌株，经对菌株16S rDNA序列进行测序、分析，并利用MEGA软件对16S rDNA序列进行聚类。49株细菌菌株分别聚成11个独立类群(见图1)，提示在猕猴桃自然酒精发酵醪中可能存在多个不同的细菌种类，推测猕猴桃自然酒精发酵醪有可能也是一个多菌株混合发酵的产物。

图1 49株细菌菌株 16S rDNA序列的聚类分析Fig.1 Cluster analysis of 16S rDNA sequences of 49 bacterial strains

在11个类群中，每一个独立类群细菌菌株的数量存在差异。其中，第10类群细菌菌株数量最高，第1类群、第9类群和第11类群的细菌菌株数量相同，第5类群的细菌菌株数量最低。结果表明猕猴桃自然酒精发酵醪中存在的不同类群细菌之间可能有特定的消长关系。

3.2 11个细菌类群的鉴定

通过Blast对核酸数据库搜索比对分析，获得与聚类确定的11个细菌类群分别相匹配的、相似性大于95%的已知菌株16S rDNA序列。然后将待分析的11个细菌类群代表菌株的16S rDNA序列与数据库下载序列重构N-J系统发育树，结果见图2。

图2 细菌菌株16S rDNA序列的邻结法系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of neighborhood method for 16S rDNA sequence of bacterial strains

注：136为1类群代表菌株；209为2类群代表菌株；12为3类群代表菌株；53为4类群代表菌株；46为5类群代表菌株；34为6类群代表菌株；184为7类群代表菌株；25为8类群代表菌株；3为9类群代表菌株；78为10类群代表菌株；81为11类群代表菌株。

第1类群(代表株为136)与已知Serratiamarcescens菌株聚为一支，初步将第1类群鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。同理，根据N-J系统发育树的聚类方式，分别将第2类群至第11类群初步鉴定为：奥斯陆莫拉菌(Moraxellaosloensis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、罗氏菌属(Rothiasp.)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusmacroides)、Bacillusaryabhattai、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、黄热芽孢杆菌(Anoxybacillusflavithermus)。11个细菌类群最后归于5个属，分别是芽孢杆菌属(Bacillus)、莫拉菌属(Moraxella)、沙雷氏菌属(Serratia)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、罗氏菌属(Rothiasp.)。

3.3 猕猴桃自然酒精发酵醪细菌α多样性分析

猕猴桃自然酒精发酵醪细菌α多样性分析表明，果蔬自然酒精发酵达到酒精浓度为16%±1%时，物种累计数(S)为10，PielouA均匀度指数(J)为0.874521，提示发酵醪细菌类群的物种多样性相对较低；香农-威纳指数(Shannon-Wiener)为2.013659，辛普森指数(Simpson)为0.8229904，Inverse Simpson 指数为5.649412，提示发酵醪的细菌类群群落均匀度较低及物种丰富度较低。结果与Jiang等[17]报道的传统发酵蔬菜微生物的α多样性一致。细菌多样性指数分析见表1。

表1 细菌多样性指数分析Table 1 Analysis of bacterial diversity index

4 结论与讨论

通过对猕猴桃自然酒精发酵醪中细菌的分离鉴定分析，其中49株细菌分属于5个属10个种。从香农-威纳指数、辛普森指数、Inverse Simpson 指数、Pielou 均匀度指数数据分析得知，猕猴桃自然酒精发酵醪中细菌种类多样性较低，丰富度和均匀度也较低，而物种累计数(S)表明果蔬发酵期间细菌物种数为10。因此，在猕猴桃自然酒精发酵醪当中尽管细菌的丰度较低，但是依然存在。自然发酵其实是一个微生物群落的共发酵，是一个动态变化的微生物生态。

通过本研究可知猕猴桃自然酒精发酵醪中蕴含着丰富的微生物资源，其中蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌属于可应用于人体的益生菌，进入肠道后通过生物夺氧作用，造成肠道低氧，拮抗肠道致病菌,促进有益菌增长，从而达到调节人体肠道环境的作用[18,19]。地衣芽孢杆菌也是高温大曲产酱香功能细菌[20]。地衣芽孢杆菌可作为一种益生菌应用于各类食品加工中，为传统发酵食品产业化生产提供了有利条件。