蜈蚣中药配伍减轻蜈蚣所致肝肾损伤的作用机制研究

田莎， 姚天振， 宁迪敏， 黄晓蒂， 郑敏楠， 龙琰， 田雪飞

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208

《素问》言：“大积大聚。其可犯也，衰其大半而止，过则死”。故大积大聚者，非峻猛之药不可攻不可散，此类药物常具毒性，这种毒性功效是双刃剑，恶性肿瘤非此类药物不能衰，但稍有不慎则会正气受损，肝肾功能损伤是安全性关键，而且是易受病人关注的敏感指标。研究组前期发现蜈蚣具有较好的抗肝癌活性[1]，然而，自古以来，蜈蚣一直被认为是有毒之虫，大凡收载蜈蚣的中药书籍均记载蜈蚣有毒，药典和教科书皆谓蜈蚣性辛温，有毒，《神农本草经》将蜈蚣列为下品。现代临床研究、药理研究表明蜈蚣具有肝肾毒性[2-7]。据此，甄选护肝中药“灵芝”、扶正中药“人参”、去莝中药“大黄”配伍蜈蚣，对比其对蜈蚣所致肝肾损伤的修复作用，为临床用药提供依据。

1 材料、试药与仪器

1.1 药物蜈蚣(批号：201700854)、人参(批号：2017020170)、灵芝(批号：2016090107)、大黄(批号：2016016470)购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科，蜈蚣经鉴定为少棘巨蜈蚣。

1.1.1 蜈蚣提取液的制备 蜈蚣干燥全虫，粉碎；加入10倍蒸馏水，浸泡30 min后煎煮提取1h左右，过滤，收集滤液；再次加8倍的蒸馏水，煎煮提取1 h左右，过滤，收集滤液；合并两次煎煮的滤液，并过滤一次，将滤液隔水蒸至相当于0.6 g生药/mL原液。以0.6 g生药/mL原液，80℃水浴30 min，连续3d间歇灭菌后，1 000 rmp离心10 min，-4℃保存。

1.1.2 灵芝、人参、大黄水提液制备 分别取灵芝、人参、熟大黄加入10倍蒸馏水浸泡30 min，武火煮沸后用文火煎煮30 min，过滤，收集滤液。再加蒸馏水8倍，煎煮提取30 min左右，合并两次滤液，滤液用旋转蒸发仪浓缩成浓度至相当于0.1 g生药材/ml。以0.1 g生药材/ml的原液，80℃水浴30 min，连续3 d间歇灭菌后，1 000 rmp离心10 min，-4℃保存。

1.2 动物SD大鼠60只，体重180～220 g、雄性。购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK(湘)2016-0002，饲养于中南大学动物实验室屏障系统内，湿度：46%～51%，温度：26～28℃，SPF级环境，实验前适应性喂养1周。

1.3 实验试剂大鼠MDA ELISA检测试剂盒(北京绿源伯德生物科技有限公司)。

1.4 仪器设备超净工作台(SW-CJ-ICV，苏净安泰公司，中国)；自动酶标仪(TECAN，奥地利)；台式离心机(TDZ5-40，长沙天创仪器公司，中国)；高压蒸汽消毒器(ZDX-35B，上海申安器械厂，中国)；超声波清洗机(杭州大和热磁力电子公司，中国)；DF-10A摇摆式中药粉碎机(温岭市奥力中药机械有限公司，中国)。

2 方法

2.1 动物分组及给药将60只SD大鼠随机分为正常对照组、蜈蚣组、蜈蚣+灵芝组、蜈蚣+人参组、蜈蚣+大黄组，每组12只。根据经验和文献[5，8]，同时参照《药理试验方法学》中人与动物体表面积折算的比值表计算，除正常组外，每组均灌胃蜈蚣水煎液4.5 g生药量/kg(相当于临床剂量的10倍)，其他组在此基础上再分别灌胃灵芝(1.08 g生药/kg)、人参(0.8 g生药/kg)、大黄(0.45 g生药/kg)(相当于临床剂量)，剂量根据人的临床剂量换算而成。正常对照组每日灌胃等体积蒸馏水。实验期间动物自由进食和饮水，给药量为3 mL/d/只，每日1次，连续14 d。

2.2 肝肾功能检测各组大鼠连续用药14 d后，禁食16 h，麻醉，腹主动脉取血，血液于室温下静置1 h，待凝固后，3 000 r/min离心15 min，吸取上层血清4℃冻存备检。OLYMPUS AU640全自动生化分析仪测定。

2.3 肝脏组织脂质过氧化物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)测定制备10%肝组织匀浆，离心取上清液100μL，按照大鼠MDA ELISA试剂盒步骤，检测MDA含量。

2.4 病理学检查肝脏组织切片经HE染色，光镜下观察肝细胞损伤程度。

2.5 统计学方法数据采用SPSS 18.0统计软件处理，多组计量资料比较采用单因素方差分析，组间多重比较如方差齐采用LSD检验，如方差不齐采用Dunnett T3检验，P<0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 体重及一般情况蜈蚣+大黄组部分大鼠在用药第3天开始出现排稀便，程度较轻，持续到实验结束，其余各组大鼠排褐色软便。在实验期间，未观察到动物竖毛、惊厥、抽搐、小便失禁等严重的中毒反应，大鼠无一死亡。各给药组及正常对照组在14d给药期内精神良好，行为活泼，毛色光泽，进水及摄食正常。各组间比较，体重无明显差异(P＞0.05)(表1)。

3.2 对谷丙转氨酶的影响组间多重比较结果显示，蜈蚣组谷丙转氨酶(ALT)高于正常组(P＜0.05)；蜈蚣+灵芝组、蜈蚣+人参组、蜈蚣+大黄组的谷丙转氨酶(ALT)低于蜈蚣组(P＜0.05)(表1)，即灵芝、人参、大黄能降低谷丙转氨酶，改善蜈蚣所致肝损伤。

3.3 对血肌酐的影响组间多重比较结果显示，蜈蚣组血肌酐(SCr)高于正常组(P＜0.05)；蜈蚣+灵芝组、蜈蚣+人参组、蜈蚣+大黄组的血肌酐低于蜈蚣组(P＜0.05)(表1)，即灵芝、人参、大黄能降低血肌酐，改善蜈蚣所致肾损伤。

表1 各组体重、谷丙转氨酶、血肌酐、丙二醛比较(±s)Table 1 Comparison of weight；ALT；SCr and MDA in each group(±s)

表1 各组体重、谷丙转氨酶、血肌酐、丙二醛比较(±s)Table 1 Comparison of weight；ALT；SCr and MDA in each group(±s)

注：与正常组比较：①P<0.05；与蜈蚣组比较：②P<0.05。

组别正常组蜈蚣组蜈蚣+灵芝组蜈蚣+人参组蜈蚣+大黄组MDA(nmol/mL)50.98±6.66 81.14.± 13.36①59.69±12.06②52.89±4.02②65.22±12.74②n 12 12 12 12 12体重(g)303.3±25.2 294.6±34.0 301.3±26.4 298.6±33.3 280.6±39.0 ALT(U/L)34.07±2.15 40.13±1.30①33.85±1.05②35.88±3.25②35.28±3.50②SCr(mmol/L)19.60±0.60 25.00±2.00①19.50±5.50②21.00±2.85②19.00±2.54②

3.4 对肝组织MDA含量的影响组间多重比较结果显示，蜈蚣组MDA高于正常组(P＜0.01)；蜈蚣+灵芝组、蜈蚣+人参组、蜈蚣+大黄组的MDA含量低于蜈蚣组(P＜0.01)，见表1，提示灵芝、人参、大黄具有抗脂质过氧化作用。

3.5 对肝组织病理变化的影响与正常组比较，蜈蚣组大鼠肝组织损伤严重，可见的肝细胞肿胀，呈气球样变，胞质疏松，部分细胞核溶解、坏死；并有炎症细胞浸润。蜈蚣+灵芝组上述症状明显减轻，与蜈蚣+人参组、蜈蚣+大黄组相近(图1)，提示灵芝、人参、大黄对大鼠肝细胞损伤有保护作用。

图1 各组肝组织HE染色（×150倍）Figure 1 Liver tissues from each group were excised and prepared for HE staining（×150）

4 讨论

蜈蚣具有一定的抗肿瘤活性，被广泛运用于各种肿瘤的治疗。临床治疗恶性肿瘤时，蜈蚣用量较大，且用药时间长，而蜈蚣作为有毒中药，具有肝肾损伤的风险。蜈蚣剂量过大可引起中毒，其中毒潜伏期约30分钟至4小时。中毒患者的主要表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、全身无力、不省人事、心跳及脉搏缓慢、呼吸困难、体温及血压下降[9]。若出现溶血反应，可伴有酱油色尿，黑便，溶血性贫血症状。大剂量服用蜈蚣粉后可致肝功能损害(5条/日，服用2天)[6]及急性肾功能衰竭死亡(2条/日，服用3天)[10]。前期研究发现相同剂量蜈蚣作用于肝癌荷瘤小鼠和正常小鼠，其肝毒性存在差异。为取得类似的肝毒性，本研究各组蜈蚣的用量选用临床剂量的10倍[[11]，结果表明，大剂量的蜈蚣提取液具有肝肾毒性。

肝癌治疗中，蜈蚣常与养肝、扶正等药物配伍。本研究甄选灵芝、人参、大黄配伍蜈蚣，观察其对蜈蚣肝肾损伤的拮抗作用。有“护肝仙草”之称的灵芝能补五脏之气，减少不良反应中药毒所致。近年大量关于灵芝的药理研究证明，灵芝及其有效成分具有独特的保护肝脏，减轻肝损伤的作用，可明显减低因药物引起的血清谷丙转氨酶和乳酸脱氢酶的含量、降低肝脏甘油三酯含量、增加对肝炎病毒的耐受性等作用[12，13]。本研究发现其具有拮抗蜈蚣所致肝肾损伤作用。人参具有大补元气，补脾益肺的作用，有研究表明其具有抗炎、抗过敏、抗休克、抗肿瘤等活性，同时人参及人参皂苷对酒精性肝损伤[14]、梗阻性黄疸大黄肝损伤、药物性肝损伤[15，16]、免疫性肝损伤[17]等均有修复作用。本研究结果表明，人参对蜈蚣所致肝肾损伤具有一定修复作用。

大黄作为具有代表性的攻下药物，具有攻下积滞、利胆退黄等功效。研究表明，大黄可通过改善内毒素血症等途径逆转肝损伤[18]。李杲曰：“大黄能推陈致新，如戡定祸乱，以致太平”，具有利胆、泻下、利小便之功效，具有利二便将药毒排除的可能，且有研究发现其具有肝肾保护作用[19-22]，被应用于药物性肝肾损伤治疗。本研究结果表明，大黄同灵芝、人参一样，具有肝肾保护作用。据此推测，下法可能是一种“去莝除毒”的积极疗法。

MDA是脂质过氧化反应的主要产物，可严重损伤细胞膜的结构，导致细胞肿胀与坏死，其含量可反映组织过氧化损伤的程度。机体组织MDA含量的增加或减少间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。多个文献报道，肝损伤发生时，肝脏MDA含量亦同时升高[23，24]，本实验证实大剂量的蜈蚣可使小鼠血清ALT活性明显上升，同时肝组织MDA含量明显增加，灵芝、人参、大黄均可显著降低小鼠血清ALT活性和肝组织MDA含量，提示灵芝、人参、大黄具有明显的抗肝损伤作用，其作用机制可能与抗脂质过氧化有关。本研究探索灵芝、人参、大黄等中药配伍对大剂量蜈蚣所致药物性肝肾损伤的修复作用，以期为临床合理谴方用药提供参考。