灯台叶碱调节放射性肺炎细胞及大鼠血清细胞因子水平的实验研究

刘珊， 蒋永新， 王洋， 张靖熙， 刘馨元， 唐琴，王思毓， 夏玉海， 刘艳艳， 沈红梅

昆明医科大学第三附属医院中西医结合科，云南 昆明 650118

放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury，RILI)是胸部恶性肿瘤(肺癌、食管癌、乳腺癌、纵膈内恶性肿瘤)在接受放射性治疗过程中正常肺组织不可避免的受到一定剂量的射线照射而造成的肺损伤[1]。放射性肺损伤作为临床上常见的放疗并发症，影响着肿瘤靶区剂量以及全局放疗的疗效，是放疗疗效最大程度发挥的主要制约因素。据国内外学者报道，放射性肺炎发生率约为29.6%～50.3%[2-4]。临床上主要是通过调整放疗方案、放疗总剂量以及放疗单次剂量等来预防、减少放射性肺炎的发生；并应用糖皮质激素、抗生素加强抗感染、辅助以非甾体药物以及运用中医中药来治疗已产生的放射性肺炎。然而，现有的治疗方法只能暂时性缓解症状，远期疗效欠佳[5]，亟需寻求安全性好、疗效佳的治疗方案。灯台叶为云南特色天然民族药，其粗提物制剂“灯台叶颗粒”和“灯台叶片”已上市使用多年，其安全性和有效性均得到临床验证，在临床上主要用于慢性支气管炎、百日咳等呼吸系统疾病的治疗。本研究建立放射性肺炎细胞及大鼠动物模型，探索灯台叶碱对放射性肺炎的治疗疗效及其机制。

1 材料及方法

1.1 材料

BEAS-2B支气管肺泡上皮细胞，购自中科院昆明生物所细胞库；雄性SD大鼠150只，SPF级，鼠龄6 w，质量(300±10)g，由湖南斯莱克景达实验动物实验有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004；胎牛血清、RPMI-1640、PBS、青霉素和链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶、流式细胞术检测试剂盒购自Hyclone公司；灯台叶碱，由中科院昆明植物所提供；流式细胞仪由美国应用生物系统公司生产。

1.2 方法

1.2.1 放射性肺炎细胞模型的建立及血清样本的采集

将BEAS-2B细胞培养于6孔板，待细胞80%融合时根据前期预实验基础选择4Gy 6Mv X-ray照射，照射24小时后换液，加入含有灯台叶碱(C=90 μg/mL)的完全培养基。待灯台叶碱作用24小时后吸取细胞液上清，4℃低温离心机中离心1 000 g 5min，取上清液体；立即分装，并将样本置于-80℃中保存，待后续实验使用。

1.2.2 流式细胞术检测细胞因子

将标准品冻干微球用4mL稀释液稀释，将最高浓度标准品倍比稀释；制备捕获微球；制备检测抗体；混匀Mixed Capture Beads；分别在各样品管和标准品管中加入50 μL的Mixed Capture Beads；分别在各样品管和标准品管中加入50 μL的标准品或样品：混匀，室温避光孵育1 h；向各管中加入 50 μL Mixed PE Detection Reagent；混匀室温孵育1 h：向各管中加入1μL Wash buffer，300 g离心5min；小心弃上清；各管加入300 μL Wash buffer重悬微球；上机分析，检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α的水平。

1.2.3 放射性动物模型的建立及分组

采用随机数字法将150只雄性SD大鼠随机分为6组，每组25只，根据前期实验基础照射剂量选择16Gy 6Mv X-ray照射大鼠全肺。

分组方式如下：(1)阴性对照组：不予放疗，给予生理盐水10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(2)单纯放疗组：放疗同时给予生理盐水10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(3)阳性对照组：放疗同时给予地塞米松注射液2 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(4)灯台叶碱低剂量组：放疗同时给予灯台叶碱10 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(5)灯台叶碱中剂量组：放疗同时给予灯台叶碱20 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周；(6)灯台叶碱高剂量组：放疗同时给予灯台叶碱40 mg/kg 10 ml灌胃，每天1次/只，共5周。

1.2.4 大鼠血清样本的采集及保存

在放射治疗后第10天、第13天、第18天和第21天分别从各组选取5只SD大鼠进行下腔静脉取血，血清管收集，将全血样品室温静置2小时，于4℃低温离心机中离心1 000 g 15 min，取上清，将样本分装至-80℃中长期保存。

1.2.5 酶联免疫吸附实验检测大鼠血清中细胞因子

设置标准品孔和待测样本孔，100 μL标准品溶液或待测样本溶液加入至每孔，轻晃，混匀，表面贴上板贴，避免温育将液体过度蒸发，37℃温箱温育2 h。弃去液体，甩干，1 00 μL生物素标记抗体工作液加入至每孔，表面重新贴上新板贴，37℃温育1 h。弃去孔中的液体，干燥并洗涤板3次，每次浸泡2分钟，200 μL/孔，甩干。100 μL HRP标记亲和素工作液加入至每孔，表面重新贴上新板贴，37℃温育1 h。弃去孔中的液体，干燥并洗涤板5次。每次浸泡2分钟，200 μl/孔，甩干。依次加，90 μL底物溶液至每孔中，37℃温箱避光显色15～30 min。依次每孔加50 μL终止溶液，使反应终止。在反应终止后5 min内，在酶标仪上依次测量各孔450 nm波长处的吸光度(OD450)，检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6的水平。

1.2.6 流式细胞术检测大鼠血清中炎症介质

方法同1.2.2，检测细胞因子TNF-α的水平。

1.2.7 统计学方法

所有统计分析采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间多重比较采用LSD-t法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灯台叶碱作用后，BEAS-2B细胞株细胞因子的变化

炎症介质分为促炎因子(IL-2、IL-6、TNF-α)与抗炎因子(IL-4、IL-6、IL-10)。细胞经4Gy放射治疗后，经浓度为90 μg/mL的灯台叶碱处理24 h后，促炎因子IL-2、TNF-α的细胞上清水平降低(P＜0.05)，抗炎因子IL-4和IL-10的细胞上清水平降低(P＜0.05)。同时作为抗炎和促炎因子的IL-6，其细胞上清水平在灯台叶碱干预后未见明显变化(见表1，图1)。

表1 灯台叶碱作用后BEAS-2B细胞株细胞因子的变化(±s)Table 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatmen(t±s)

表1 灯台叶碱作用后BEAS-2B细胞株细胞因子的变化(±s)Table 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatmen(t±s)

*：P＜0.05，差异有统计学意义。

细胞因子IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α P值0.0027*0.0063*0.6494 0.0074*0.0407*灯台叶碱作用前(pg/ml)8.720±0.2417 10.60±0.2714 11.96±0.1808 2.590±0.2483 8.243±0.2050灯台叶碱作用后(pg/ml)6.383±0.2571 8.863±0.1915 12.23±0.5197 1.263±0.8969 6.647±0.4948

图1 灯台叶碱作用后BEAS-2B细胞株细胞因子的变化Figure 1 Cytokine changes of BEAS-2B cell line after alstonia-leaf alkaloids treatment

2.2 灯台叶碱作用后大鼠血清中细胞因子的变化

2.2.1 IL-2的变化

放疗后地塞米松阳性对照组的IL-2的血清水平自放疗后10日起维持低水平的状态；放疗后10日起，IL-2作为促炎因子，单纯放疗组其血清水平在短暂升高后呈持续下降趋势，总体水平接近灯台叶碱治疗组，而高于阳性对照组及阴性对照组；低剂量组高于中剂量组，高剂量组介于二者之间(见图2)。

2.2.2 IL-4的变化

IL-4是抗炎炎症介质，自放疗后经灯台叶碱处理的第10日IL-4血清水平呈现出上升趋势，但上升程度无显著灯台叶碱剂量依赖性，阳性对照组、阴性对照组和放疗组自第10日起血清水平始终维持低水平状态(见图3)。

图2 大鼠血清中细胞因子IL-2的变化Figure 2 Changes of cytokine IL-2 in rats serum

图3 大鼠血清中细胞因子IL-4的变化Figure 3 Changes of cytokine IL-4 in rats serum

2.2.3 IL-6的变化

IL-6具有抗炎和促炎的双重作用，灯台叶碱作用下低剂量组和中低剂量组的IL-6血清水平逐渐下降，高剂量组IL-6的血清水平逐渐升高。阳性对照组和阴性对照组自第10日起血清水平始终维持低水平的波动状态，单纯放疗组始终维持高水平的波动状态(见图4)。

2.3 TNF-α的变化

图4 大鼠血清中细胞因子IL-6的变化Figure 4 Changes of cytokine IL-6 in rats serum

肺组织遭受电离辐射的损伤后，TNF-α的血清水平升高，随着灯台叶碱的作用，TNF-α血清含量逐渐下降，但TNF-α的下降程度无明显的灯台叶碱剂量依赖性；单纯放疗组TNF-α的血清水平始终处于高水平的波动状态；阳性对照组及阴性对照组TNF-α的血清水平在放疗后第10天已处于低水平的状态(见图5)。

图5 大鼠血清中细胞因子TNF-α的变化Figure 5 Changes of cytokine TNF-α in rats serum

3 讨论

放射治疗是肺癌、乳腺癌、食道癌等胸部肿瘤患者的主要治疗手段。肺是辐射中度敏感器官，放射治疗可使肿瘤附近的肺组织因受到放射剂量超过其生物效应的阈值而产生不同程度的损伤。一旦发生严重的放射性肺损伤，必将终止放射治疗，转而以大剂量口服糖皮质激素控制炎症为主。然而，糖皮质激素带来的副作用不容忽视，可能耽误胸部肿瘤治疗的最佳时机，加大肿瘤浸润和转移的风险，威胁患者生命[6，7]。因此，现有的治疗放射性肺炎的方法仅能暂时缓解临床症状，可导致全身多器官和系统的损伤，实际并未改善患者生活质量。临床迫切需要寻求一种安全有效的治疗。在临床及实验研究中，中药预防和治疗放射性肺炎受到越来越多的重视。

灯台叶多产于云南、广东等地，生于海拔650 m以下丘陵山地疏林中，为云南及两广等地少数民族用药，性凉、味苦，能止咳祛痰、退热消炎，属被子植物门、夹竹桃科。曾收载于地方药志，如《陆川本草》、《云南中草药选》中，并为《云南省药品标准》(1974)和《中国药典》(1977年版一部)所收载。传统中药灯台叶碱获取容易，价格低廉，是从灯台叶中提取分离的有效成分，具有止咳平喘、清热解毒的功效，用于急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作期(风热袭肺证)。灯台叶对放射性肺炎是否有治疗作用目前尚未见报道。

有研究发现放射性肺炎患者肺泡灌洗液中TNF-α分泌增加，但这种反应在4个月内达到平台期，这表明，TNF可能在放射性肺炎的早期阶段发挥作用[8]。本研究中TNF-α的变化与文献报道一致，放疗后血清中TNF-α水平上升，经灯台叶碱作用后下降，我们猜测灯台叶碱可能在早期通过阻断TNF与TNF受体的结合，从而阻断下游信号的转导，同时认为早期放射性肺疾病的血清TNF敏感性高，TNF能够促进炎症的进展。

白细胞介素(ILs)衍生自肺巨噬细胞以及多种非巨噬细胞来源(例如，肺泡上皮细胞、成纤维细胞和肥大细胞等)。TNF-α和IL-2(早期炎症反应的细胞因子)的研究确立了这些介质在肺血管粘附分子上调中的首要地位。IL-8细胞因子家族作用于白细胞上具有趋化和血管生成活性，能够诱导胶原合成和细胞增殖[9]。本研究显示：SD大鼠照射后血清IL-2、IL-6、TNF-α含量短期内立即升高，提示IL-2、IL-6和TNF-α均作为抗炎介质在放射性肺炎的早期发挥作用；灯台叶碱干预后SD大鼠IL-2和IL-6的血清水平与TNF-α变化趋势相同，呈下降趋势，说明灯台叶碱对照射后SD大鼠IL-2和IL-6有一定抑制作用，在第4周血清IL-2和IL-6含量与地塞米松组持平，可见，灯台叶碱能有效减轻炎性反应；SD大鼠血清中的抗炎因子IL-4在灯台叶碱干预后呈现上升的趋势，表明灯台叶碱能增强大鼠的免疫系统功能，刺激大鼠免疫系统自我调节以维持内环境的稳态，这种效应在第4周时IL-4血清含量达到最高，高于地塞米松组血清IL-4水平，说明灯台叶碱可能较地塞米松的抗炎效应更佳。我们猜测其治疗机制与文献报道类似，为单萜吲哚类生物碱促进支气管平滑肌高尔基体钙库外流，激活PLC-IP3/DAGPKC信号通路而起到镇咳作用[10]；同时可能通过增强组织内谷胱甘肽(GSH)过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低过氧化水平，达到抗炎镇痛的效果[11]。IL-2、TNF-α在细胞及动物实验中趋势相反，原因考虑为：①细胞和动物试验中检测细胞因子时样本经过放射治疗后的时间并不相同，放疗有延迟效应，可能导致结果的差异；②细胞和动物样本在很多方面存在差异，可能导致最终细胞因子结果有一定差异。具体原因尚待进一步研究。

本研究通过对灯台叶碱的治疗机制研究，发现灯台叶碱可成为促炎因子的阻断剂，有望成为临床防治放射性肺炎的有效药物。