丹参酮ⅡA对人肝癌细胞Huh7增殖与凋亡的影响

赵珍， 李明花

山西中医药大学，山西 晋中 030619

2012年世界癌症统计显示全球范围内肝癌的新发病例是78.2万，死亡病例是74.5万，其中我国新发病例和死亡病例均占50%以上[1]。2015年全国癌症统计报告中显示肝癌发病率和死亡率均居前三[2]，合并所有阶段，肝癌5年的生存率不超过17%[3]。所有肝癌病例中，肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的发生率占70%～90%，肝细胞癌的主要风险因素包括：乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，酒精性肝硬化及非酒精性肝病综合征等[4-6]。尽管肝癌的早期治疗手段以及诊断技术日益提高，但目前疗效仍然不容乐观，生存期短且易转移和复发，缺乏根治的方法，因此临床上急需开发高效、低毒或可作用于新靶点的药物。与西药比较，中药毒副作用更小，更容易被患者接受，在抗肿瘤治疗中起重要作用。

丹参酮ⅡA(TanⅡA)是一种从丹参中分得的脂溶性单体，呈桔红色针状结晶，易溶于二甲基亚砜和乙醇醇等有机溶剂，微溶于水[7，8]。丹参为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，味苦，微寒，归心、肝经，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效。Chao Lv等[9]通过做细胞毒性实验、双染流式细胞术以及Western blot实验，发现与对照组相比，丹参酮ⅡA对MCF-7细胞具有显著的抑制力，它的机制可能与抑制凋亡蛋白Bcl-2，和激活Caspase-3有关。本实验对丹参酮ⅡA的体外抗肝癌作用进行了初步研究，为更好地开发利用丹参酮ⅡA提供实验依据。

1 材料

1.1 药物及细胞

丹参酮ⅡA购买于上海一林生物科技有限公司，高效液相色谱法(HPLC)检测药物的纯度≥98%，产品CAS号为35825-57-1。丹参酮ⅡA溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，丹参酮ⅡA储存液浓度为20 mmol·L-1，储存于-20 ℃备用。

Huh7细胞株购自中国科学院上海细胞库，来源于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 主要试剂与仪器

图1 丹参酮ⅡA的化学结构Figure 1 Chemical structure of tanshinone IIA

DMEM培养基、PBS缓冲液、胎牛血清(美国Science cell公司)、二甲基亚砜(DMSO)、青霉素链霉素双抗(美国Gbico公司)、胰酶、胎牛血清(美国Science cell公司)；CCK-8试剂；RIPA裂解液；蛋白定量试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒；蛋白酶抑制剂、p53抗体和tublin抗体购自美国Proteintech公司；Cleaved-PARP和Caspase-9抗体均购自中国碧云天生物技术公司；山羊抗兔和驴抗小鼠二抗均购自香港IRDye 800CW公司；实验用到的试剂规格都为国产分析纯。

HF90 CO2培养箱；PowerPac Basic电泳仪、Odyssey FC双色红外激光成像系统(香港Gene Company Limited公司)；Leica TCS SP8显微镜(德国Leica公司)，Epoch全波长酶标仪；BD FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Diskon公司)；TC10细胞计数仪(美国Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 CCK-8法检测细胞增殖

将人肝癌Huh7细胞消化收集，细胞悬液以5×103个细胞/孔的密度均匀接种于96孔板中，每孔100 μL培养基，并置于37℃、5%CO2培养箱内培养过夜。待细胞12 h贴壁后，实验分为空白组、对照组以及给药组，每组设置4个复孔，对照组加0.1%DMSO，给药组加入浓度分别为1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L丹参酮IIA。给药24 h后更换新鲜的培养基，每孔避光加入10 μL CCK-8试剂，振荡混匀，置于培养箱孵育1.5 h。使用酶标仪于450 nm波长处测定各孔吸光度光密度(optical density，OD)值，计算丹参酮IIA对细胞增殖抑制率，通过GraphPad Prism6.0软件计算半数抑制浓度(IC50)，重复3次实验，取平均值。

细胞增殖抑制率(%)=1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)

2.2 显微镜下观察细胞形态

将人肝癌Huh7细胞消化收集，细胞悬液以7×105个细胞/孔的密度均匀接种于6孔板中，每孔2 mL培养基，并置于37℃、5%CO2培养箱内过夜。待细胞12 h贴壁后，实验分为空白组和给药组，每组设置3个复孔，给药浓度分别为2.5、5、10、20 μmol/L。培养24小时后，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。

2.3 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期

将人肝癌Huh7细胞消化收集，细胞悬液以7×105个细胞/孔的密度均匀接种于6孔板中，每孔2 mL培养基，并置于37℃、5%CO2培养箱内过夜。待细胞12 h贴壁后，实验分为空白组和给药组，每组设置3个复孔，给药浓度分别为2.5、5、10、20 μmol/L。培养24小时后胰酶消化收集各组细胞悬液，使用PBS洗涤2次，检测细胞周期时，向各组细胞加入5 μL Annexin V，FITC结合物，再加入5 μL PI染色液，最后加入400 μL PBS，在室温下避光培养15 min，加样到流式细胞仪检测。检测细胞周期时，按照细胞周期检测试剂盒说明书操作，加样到流式细胞仪检测各阶段细胞的百分率。

2.4 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达

将人肝癌Huh7细胞消化收集，细胞悬液以5×106个细胞/孔的密度均匀接种于10 cm培养皿中，每孔8 mL培养基，并置于37℃、5%CO2培养箱内过夜。待细胞12 h贴壁后，实验分为空白组和给药组，给药浓度分别为2.5、5、10、20 μmol/L。培养24小时后，加入适量预冷的PBS，使用细胞刮收集细胞，离心(4 000 rpm、4℃、3 min)，重复以上操作2次，细胞中加入适量RIPA裂解液，冰上裂解20 min后，离心(13 000 rpm、4℃、15 min)，吸出上清蛋白，切勿吸出碎片。蛋白定量采用BCA法，沸水中煮5 min，取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳完成后切胶，转膜70 min，电转在低温下进行，将终止的PVDF膜取出，TBST洗膜3次，取出膜后用5%脱脂牛奶封闭1 h，分别使用脱脂牛奶稀释的一抗Caspase-9(1∶1 000)、Cleaved-PARP(1∶1 000)、p53(1∶2 000)和Tublin(1∶5 000)孵育过夜，回收一抗，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗孵育2 h，TBST再次洗膜3次，每次5 min，采用扫膜仪进行扫膜，实验重复操作3次。

2.5 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间均数的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 丹参酮IIA对Huh7细胞增殖的影响

结果如图2所示，不同浓度的丹参酮IIA作用于人肝癌Huh7细胞24 h后，和对照组比较，细胞增殖抑制率随着丹参酮IIA浓度的增大而升高，药物作用24 h的IC50为8.76 μmol/L。

图2 丹参酮ⅡA对Huh7细胞增殖的影响(±s，n=3)Figure 2 Effect of tanshinoneⅡA on proliferation of Huh7 cells(±s，n=3)

3.2 丹参酮IIA对Huh7细胞形态的影响

结果如图3所示，不同浓度(2.5、5、10、20 μmol/L)丹参酮IIA作用于人肝癌Huh7细胞24h后，与对照组比较，细胞数量随着丹参酮IIA浓度的增大呈逐渐减少的趋势。当丹参酮IIA浓度达到10 μmol/L时，细胞出现明显的皱缩现象，呈凋亡的状态。

图3 丹参酮IIA对Huh7细胞形态的影响（100×）Figure 3 Effect of tanshinone IIA on morphology of Huh7 cells（100×）

3.3 丹参酮IIA对Huh7细胞凋亡的影响

结果如图4所示，不同浓度(2.5、5、10、20 μmol/L)丹参酮IIA处理细胞24 h，与对照组比较，随着丹参酮IIA给药浓度的升高，细胞凋亡率明显增加，尤其在20 μmol/L时，其凋亡率达到53.46%，各组差异具有统计学意义(P<0.05)。

3.4 丹参酮IIA对Huh7细胞周期的影响

图4 丹参酮IIA对Huh7细胞凋亡的影响(±s，n=3)Figure 4 EEffect of tanshinone IIA on apoptosis of Huh7 cells(±s，n=3)

结果如图5所示，不同浓度(2.5、5、10、20 μmol/L)丹参酮IIA作用于人肝癌Huh7细胞24 h后，和对照组比较，随着丹参酮IIA给药浓度的增加，各组细胞的周期均发生了显著变化，G1期细胞呈浓度依赖性增多，S期细胞逐渐减少，表明丹参酮IIA具有阻滞细胞周期的作用，阻滞周期于G1期，各组差异具有统计学意义(P<0.05)。

图5 丹参酮IIA对Huh7细胞周期的影响(±s，n=3)Figure 5 Effect of tanshinone IIA on cell cycle of Huh7 cells(±s，n=3)

3.5 丹参酮IIA对Huh7细胞凋亡相关蛋白表达的影响

结果如图6所示，不同浓度(2.5、5、10 μmol/L)丹参酮IIA作用于Huh7细胞24 h后，以Tublin作为内参，与对照组比较，随着丹参酮IIA浓度的增大，人肝癌Huh7细胞cleaved-PARP、Caspase-9以及p53蛋白水平表达逐渐升高，促凋亡效果明显。各组差异具有统计学意义(P<0.05)。

图6 丹参酮IIA对Huh7细胞凋亡蛋白表达的影响(±s，n=3)Figure 6 Effect of tanshinone IIA on protein expression of apoptosis in Huh7 cells(±s，n=3)

4 讨论

肝癌为常见的消化道恶性肿瘤，在我国其死亡率在恶性肿瘤中居第二位，且呈逐年上升趋势[10]。传统的手术治疗和放化疗都有一定局限性，且治疗后易复发，对机体的继发性损伤也很大，药物治疗仍是肝癌治疗的主要手段之一。丹参酮IIA是从唇形科植物丹参中分离得到的主要活性单体之一，近年来许多研究表明丹参酮IIA在体外具有良好的抗肿瘤作用，可显著抑制前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌和肝癌的生长，诱导细胞凋亡以及调控细胞周期分布[11]。

研究发现，许多中药可以通过抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡、抑制侵袭转移等达到控制肝癌细胞的目的[12-15]。本研究主要对天然化合物丹参酮IIA对影响人肝癌Huh7细胞的增殖和凋亡作用进行研究，结果表明Huh7细胞增殖活力随着丹参酮IIA浓度的增大而降低；晚期凋亡细胞比例明显增多；细胞周期显著阻滞在G1期；表明在体外丹参酮IIA对Huh7细胞的抗肿瘤作用较强。

多数情况下，抗肿瘤药物杀死肿瘤细胞的方法是通过诱导细胞凋亡来实现。如P53、cleaved-PARP以及Caspase-9等基因与肿瘤细胞凋亡具有密切关系，它们对于研究肿瘤细胞凋亡机制具有研究意义；同时也是重要的靶蛋白[16]和重要的抑癌基因，它们的突变对肿瘤的发生发展起着重要作用，其在肝癌的上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)及转移中同样发挥功能。p53是最早发现的具有抑制肿瘤作用的蛋白之一，可以诱导细胞凋亡、调控细胞周期、抑制肿瘤血管生成以及使基因组趋于稳定。p53的抗肿瘤作用主要是通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而实现的[17]。Caspase是促使细胞凋亡的最终途径。在介导细胞凋亡的过程中发挥关键的作用，是多条凋亡通路的汇聚点，是执行凋亡的最终途径。此外，Caspase发挥作用的另一途径是完成自我活化，该过程是通过相互激活来实现的，Caspase9是最重要的凋亡始动子之一，它位于级联反应上游，一旦出现级联放大效应[18]，在其他蛋白参与下，Caspase9会发生自我激化。通过蛋白质免疫印迹实验，本研究发现丹参酮IIA可以提高促凋亡蛋白cleaved-PARP、Caspase-9以及p53的表达水平，具有显著的诱导Huh7细胞凋亡的作用。

综上所述，本研究发现丹参酮IIA对Huh7细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用，这个凋亡过程是caspases及p53参与的，具有很好的抗肝癌活性，这为研究丹参酮IIA抗肿瘤作用提供了一定的理论和实验依据。