南方红豆杉水煎液HPLC特征图谱方法的初步建立

冯小权， 廖娴， 黄月纯， 陈坚雄， 黄可儿， 利创华

1.广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405；2.广州市医药职业学校，广东 广州 510430

红豆杉是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。我国红豆杉有4种及1个变种，南方红豆杉(T.chinensisi，Rehd.var.mairei)是我国分布最为广泛的红豆杉属植物变种[1]。从红豆杉树皮和嫩叶中提取的紫杉醇，是天然抗癌药，但其临床疗效及紫杉醇在水环境中的降解动力学研究结果，水提取物中主要有效成分并非微克级含量的紫杉醇[2]。水煎剂是中药应用的传统方式及临床应用的主要形式，南方红豆杉具有一定的抗肿瘤作用，其水煎剂已在临床广泛应用，且安全有效[3-7]。

目前对南方红豆杉的研究主要集中在化学成分、药理作用、繁殖技术等方面，而关于南方红豆杉水煎液特征图谱的研究报道较少。高效液相色谱法(HPLC)是目前广泛应用于药物分析和质量控制领域的色谱技术。为了较全面反映南方红豆杉水煎液质量评价指标，本文采用HPLC特征图谱分析技术建立南方红豆杉水煎液特征图谱，为进一步采购不同批次的南方红豆杉时作质量判断和把关，为下一步建立南方红豆杉水煎液在大鼠血清中UPLC特征图谱的分析方法提供方法学参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HP1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.2 材料

紫杉醇对照品(批号：111276)购自北京普天同创生物科技有限公司，面积归一法液相色谱结果≥98%；甲醇、乙腈为色谱纯(德国Merck公司)；水为屈臣氏蒸馏水；其他试剂均为分析纯。南方红豆杉中药饮片购自广州中医药大学第一附属医院中药房，经梁文能副主任中药师鉴定为南方红豆杉(Taxus.Chinensis.Var.Mairei)红豆杉科红豆杉属植物紫杉人工栽培品的干燥枝叶。南方红豆杉由康美药业股份有限公司提供，产地均为浙江，4个批号分别：180350491、181150561、190250181、190550401。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱ZORBAX SB-Aq(4.6×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱(0～20 min，3%～10%A；20～50 min，10%～25%)；流速：1 ml·min-1，柱温：25℃；检测波长：300 nm，进样量：2μl。

2.2 对照品溶液的制备

取紫杉醇对照品3.8 mg，精密称取，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，精密吸取1 ml置25 ml容量瓶，加甲醇定容至刻度，配制成浓度为3.04 μg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取10 g南方红豆杉置于不锈钢锅，加15倍水浸泡30 min，煮沸30 min，倒出药液，后加10倍水煮沸20 min，再8倍水煮沸20 min，合并3次药液过滤，置电磁炉上浓缩至成约药液5 ml，得2 g·ml-1(生药量)红豆杉水煎液[2]。精密吸取水煎液4 ml，加甲醇6 ml，放置2 h，超声处理20 min，取出，放冷，离心，取上清液至10 ml量瓶中，加60%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液，连续进样6次，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

取同一批南方红豆杉药材，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别精密吸取2 μl进行高效液相色谱仪测定分析，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明该方法重复性良好，方法学考察可行。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液2 ml，分别在0、2、8、12、24小时进样，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液24小时内稳定性良好。

2.7 样品测定

取不同批次的南方红豆杉样品，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，结果见表1，图1，图2。

表1 4批南方红豆杉水煎液HPLC特征图谱测定结果Table 1 Test results of HPLC characteristic spectrum for 4 batches aqueous extract of Taxus chinensis var.Mairei

图1 4批南方红豆杉水煎液HPLC特征图谱重叠图Figure 1 HPLC characteristic spectrum overlapping for 4 batches aqueous extract of Taxus chinensis var.Mairei

图2 4批南方红豆杉水煎液HPLC特征图谱共有模式图Figure 2 Common pattern of HPLC characteristic spectrum for 4 batches aqueous extract of Taxus chinensis var.Mairei

3 讨论

根据特征峰紫外光谱特点，本试验考察了不同柱温(25℃、30℃、35℃)对分离效果的影响，结果以25℃时效果最优。筛选不同流速(0.8、1.0、1.2 ml·min-1)对分离效果的影响，结果以为1 ml·min-1效果最优。筛选不同流动相(乙腈-水、甲醇-水)梯度洗脱方法对分离效果的影响，结果差异不明显。考察了不同检测波长(227、228、232、254、300、310 nm)分离效果，在227 nm条件下，紫杉醇对照品有最大吸收，干扰较少，基线较平稳，但其他特征峰基本无吸收或吸收较小。根据对特征峰紫外光谱分析，较多特征峰在310 nm波长有大吸收，特征峰较丰富，特征图谱相似度较高，故本文选用310 nm作为南方红豆杉水煎液HPLCT特征谱检测波长。经方法学考察，本试验所建立的色谱条件方法可行，符合中药色谱指纹图谱建立的技术要求，可用于南方红豆杉水煎液HPLC特征图谱检测。

紫杉醇是从红豆杉树皮提取分离的天然次生代谢产物，对癌细胞生长起到抑制作用，是具有抗癌效应的中药材[8]，是南方红豆杉中药材质量评价的主要指标成分之一，本文探讨波长227 nm检测方法可作为南方红豆杉品种的快速鉴别方法提供参考。前期实验过程中发现紫杉醇对照品在227 nm左右不吸收。经查文献，有报道储存对照品溶液的聚乙烯等塑料EP管对紫杉醇的稳定性及其不利，推测紫杉醇很可能在塑料管壁上发生吸附作用[9]，因而可检测的自由分子浓度过低导致在波长227 nm无法检测特征峰。紫杉醇的吸附作用涉及紫杉醇的生物和化学反应行为，值得在今后的研究中深入探讨。

由于收集较多批次南方红豆杉样品存在一定困难，本文只初步建立了南方红豆杉水煎HPLC液特征图谱检测方法，特征峰成分分析有待后续收集更多批次样品进一步完善研究，且以期找寻相对应的标准品对特征峰成分鉴定，在后续实验研究中拟采用质谱分析方法，对此类结构进行解析。