多壁碳纳米管净化-超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡蛋中44种药物残留

蒋 湘,吴 毅,黄燕红,刘珈伶,赵就彬

(广西-东盟食品药品安全检验检测中心,广西南宁 530001)

随着人们生活水平的提高,鸡蛋已成为餐桌上不可或缺的食物。在禽类养殖过程中,兽药起到防治疫病的重要作用,由此造成兽药及其代谢物在禽蛋中残留超标的现象屡有发生。氯霉素类药物(Chloramphenicols)能够抑制易感细菌中的蛋白质合成,广泛用于禽畜生产,但该类药物在易感人群中易引起再生障碍性贫血[1],因此,在家禽产蛋期间禁止使用,我国农业部公告第235号[2]规定动物源食品不得检出氯霉素类药物。氟虫腈类药物(Fluorine nitrile)为广谱杀虫剂,其代谢产物有氟虫腈砜、氟虫腈硫醚和氟甲腈,代谢物毒性均强于原药,我国农业部于2009年发布公告停止生产销售氟虫腈农药[3]。抗病毒类药物(Antiviral)是一类用于治疗甲型流感病毒感染的抗病毒剂,常被非法用于养鸡业[4],其对人体神经系统造成危害[5],我国农业部560号公告规定养殖业禁止使用金刚烷胺、金刚乙胺类抗病毒药物[6]。磺胺类药物(Sulfonamides)是一组用于治疗和预防人类和动物感染的抗菌药物,因其广谱活性和低成本而被广泛使用,但其在动物体内代谢缓慢,对人体易造成蓄积危害,特别是机体对抗生素的耐药性[7-8]。我国对禽蛋中磺胺类兽药尚未制定残留限量值。硝基咪唑类药物(Nitroimidazoles)是治疗和控制大肠杆菌或沙门氏菌所引发疾病的抗生素,用于禽畜养殖中疾病治疗与控制,因其具有潜在的致癌性和致突变性[9],我国明确该类药物不得在动物源食品中检出[2]。

药物残留分析方法主要有气相色谱法[10]、高效液相色谱法[11]、气相色谱-质谱联用法[12]、高效液相-质谱联用法[13-14],高效液相-质谱联用法因具有高灵敏度、高选择性而被广泛用于药物多残留的分析。药物残留分析前处理技术主要有固相萃取[15]、多壁碳纳米管[16-18]、QuEChERS技术[19-20]等。多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nano-tube,MWCNT)为新型吸附材料,由于其独特的结构和巨大的表面积,可以作为有效的吸附剂来吸附复杂基质中的干扰物质[21]。QuEChERS(快速、简便、便宜、有效、坚固和安全)方法在首次引入后经过分析工作者的不断改良,已广泛用于各种食品基质中的农药和兽药多残留分析。

目前我国国家标准和行业标准中关于兽药残留前处理方法主要为固相萃取、液-液萃取、QuEChERS技术,并且大部分应用高效液相-串联质谱法对各种类型的药物残留进行分类检测,检测成本高,效率低。本研究以乙腈沉淀蛋白,改良QuEChERS技术,以多壁碳纳米管、十八烷基键合硅胶、乙二胺-N-丙基硅烷(MWCNTs-C18-PSA)3种吸附剂组合净化样品,建立超高效液相色谱-质谱联用方法测定氯霉素、氟虫腈、抗病毒、磺胺、硝基咪唑5大类共44种药物残留量的高通量方法,并对82批鸡蛋中药物残留进行快速筛查。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、甲酸、甲酸铵 色谱纯,德国Merck公司;实验用水 超纯水(18.2 MΩ);盐包 无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末(4∶1,质量比),Waters公司;多壁碳纳米管 MWCNTs,纯度95%,长度10～30 μm,直径10～20 nm,XFNANO公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18粉 CNW公司;标准物质:氯霉素(Chloramphenicol)、氟苯尼考(Florfenicol)、甲砜霉素(Thiamphenicol)、氟虫腈(Fipronil)、氟甲腈(Fipronil-desulfinyl)、氟虫腈砜(Fipronil-sulfone)、氟虫腈亚砜(Fipronil-sulfide)、金刚烷胺(Amantadine)、金刚乙胺(Rimantadine)、美金刚(Memantine)、咪喹莫特(Imiquimod)、吗啉胍(Moroxydine)、奥司他韦(Oseltamivir)、甲氧苄啶(Trimethoprim)、磺胺二甲异嘧啶(Sulfisomidine)、磺胺醋酰(Sulfacetamide)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine)、磺胺吡啶(Sulfapyridine)、磺胺噻唑(Sulfathiazole)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine)、磺胺二甲嘧啶(Sulfamethazine)、磺胺甲氧嗪(Sulfamethoxypyridazine)、磺胺恶唑(Sulfamoxol)、磺胺甲氧嘧啶(Sulfameter)、磺胺间甲氧嘧啶(Sulfamonomethoxine)、磺胺氯哒嗪(Sulfachloropyridazine)、磺胺邻二甲氧嘧啶(Sulfadoxine)、磺胺甲基异恶唑(Sulfamethoxazole)、磺胺异恶唑(Sulfisoxazole)、磺胺苯酰(Sulfabenzamide)、磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine)、磺胺喹沙啉(Sulfaquinoxaline)、磺胺苯吡唑(Sulfaphenazole)、磺胺甲二唑(Sulfamethizole)、磺胺吡唑(Sulfapyrazole)、羟基甲硝唑(1H-Imidazole-1-ethanol)、2-甲硝咪唑(2-Methyl-5-nitroimidazole)、羟甲基甲硝咪唑(1-Methyl-5-nitro-1H-imidazole-2-methanol)、甲硝唑(Metronidazole)、洛硝哒唑(Ronidazole)、地美硝唑(Dimetridazole)、苯硝咪唑(Benzimidazole)、异丙硝唑(Ipronidazole)、奥硝唑(Ornidazole) 纯度均大于98%,德国Dr.E公司;鸡蛋 来自广西多个地市(包括南宁市、桂林市、柳州市、百色市等11个地区)共82批,所有鸡蛋均取可食用部分,绞碎均质(3000 r/min,2 min)后,-20 ℃冷冻保存。

岛津20A高效液相色谱仪 日本岛津公司;API 4500 Q-TRAP三重四级杆串联质谱仪 美国AB公司;OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H色谱柱(2.0×100 mm,3 μm) 日本大曹三耀公司;氮吹仪 北京八方世纪公司;氮气发生器 英国PEAK公司;高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher公司;涡旋振荡器 德国HEIDOLPH公司;Milli-Q超纯水器 法国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 称取2.00 g(精确到0.01 g)混匀的蛋液于50 mL聚丙烯离心管中,加入4 mL水和10 mL乙腈,混匀后再加入盐包,迅速振摇2 min,在4 ℃条件下离心(10000 r/min)5 min,取2.0 mL上清液,加入多壁碳纳米管-固相萃取(MWCNTs-C18-PSA)组合(10 mg MWCNTs+25 mg PSA+25 mg C18),涡旋30 s后,4600 r/min离心5 min,取1.0 mL 40 ℃水浴氮吹浓缩至近干,加10%乙腈定容至1 mL,涡旋混匀,用微孔滤膜(0.22 μm)过滤,取续滤液,用于测定。

1.2.2 标准溶液的配制

1.2.2.1 标准储备液 分别称取44种标准物质适量,用乙腈溶解并定容,配成质量浓度均为1 mg/mL的标准储备液,于-20 ℃条件下保存,有效期一个月。

1.2.2.2 混合标准使用液 分别吸取适量(氯霉素类、氟虫腈类、抗病毒类、磺胺类、硝基咪唑类)标准储备液(1 mg/mL),用乙腈配成标准中间液(1 μg/mL);精密量取44种标准中间液0.1、0.5、1.0 mL分别置于10 mL量瓶中,用乙腈稀释至刻度,混匀(质量浓度分别为10、50、100 ng/mL),为标准使用液①～③,精密量取44种标准中间液1.0 mL置于10 mL离心管中,氮吹至近干,用乙腈溶解转移至2 mL量瓶中并定容至刻度(质量浓度为500 ng/mL),为标准使用液④,于-20 ℃冰箱中保存,有效期2周。

1.2.2.3 基质混合标准工作曲线 取空白样品10份,照1.2.1提取,得到空白基质溶液,根据实验需要配成质量浓度为0.1、0.5、1、5、25、50、100、200 ng/mL基质混合标准工作曲线,于4 ℃条件下保存。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H色谱柱(2.0 mm×100 mm,3 μm);流动相:A为0.1%甲酸水,B为0.1%甲酸甲醇;进样量:2 μL,流速:0.3 mL/min;柱温:40 ℃。梯度洗脱条件:0～15.0 min,2% B→50% B;15.0～21.0 min,50% B→90% B;21.0～23.0 min,90% B;23.0～23.1 min,90% B→2% B;23.1～25.0 min,2% B。

1.2.4 质谱条件 采用ESI源,正离子、负离子同时多反应监测模式(MRM)检测,气帘气压力(CUR)241.325 kPa,正离子:喷雾电压(IS)4500 V,离子源温度(TEM)550 ℃,入口电压(EP)10 V,碰撞室出口电压(CXP)12 V;负离子:喷雾电压(IS)-4500 V,离子源温度(TEM)550 ℃,入口电压(EP)-10 V,碰撞室出口电压(CXP)-8 V。

1.3 数据处理

采用MultiQuant和Excel 2010软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

多反应监测(MRM)离子对、质谱采集参数、保留时间,见表1,其中以化合物的色谱保留时间和两对MRM离子对进行定性,定量MRM离子对的峰面积进行定量。优化后质谱条件的正负离子模式总离子流图如图1所示。

续表

续表

图1 负离子模式(A)分析7种药物和正离子模式(B)分析37种药物的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of the 7 drugs in negative ion mode(A)and the 37 drugs in positive ion mode(B)注:图中峰注释数字与表1中各数字所代表的化合物一致。

2.2 色谱条件的优化

本研究选择色谱柱1(OSAKA SODA CAPCELL PAK MGIII-H,2.0 mm×100 mm,3 μm)、色谱柱2(ACQUITY UPLC BEH C18,2.1 mm×100 mm,1.7 μm)、色谱柱3(Thermo Hypersil GOLD,2.1 mm×100 mm,1.9 μm)和色谱柱4(Agilent SB-Aq RRHD,2.1 mm×100 mm,1.8 μm)对44种药物进行分离。结果显示,在相同色谱条件下,色谱柱1的响应值较高,形成的色谱峰峰形尖锐,对称性好,分离效果较佳,杂质干扰小,对磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶三个同分异构体化合物的分离效果较其它三根色谱柱好,因此选择色谱柱1为分析柱,具体见图2。

图2 磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶在相同流动相体系不同色谱柱中的色谱图Fig.2 Chromatograms of sulfamethoxypyridazine,sulfameter and sulfamonomethoxine in different columns of the same mobile phase system

2.3 流动相的优化

2.3.1 有机相选择 本研究中有三组同分异构体,分别为金刚乙胺和美金刚、磺胺恶唑和磺胺异恶唑、磺胺甲氧嗪、磺胺甲氧嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶,同分异构体的碎片离子质量数存在高度的一致性,因此在LC-MS/MS分析时存在互相干扰。本研究通过改变流动相组成发现,在相同梯度条件下,采用乙腈作为有机相时,洗脱能力强导致出峰较快,同分异构体无法分离,而使用甲醇为流动相时,甲醇的极性、洗脱能力弱于乙腈,同分异构体间的分离度得到改善,色谱图见图3。

图3 金刚乙胺和美金刚标准溶液的MRM色谱图Fig.3 MRM chromatogram of rimantadine and diamond standard solutions注:A:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水;B:0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水;峰注释数字与表1中各数字所代表的化合物一致。

2.3.2 水相的选择 流动相中加入酸是为了给化合物在正离子模式下更好的提供质子,为使整个分析过程中酸度保持相对稳定,故在流动相A和流动相B中均添加了甲酸。水相分别添加0.1%甲酸、5 mmol/L甲酸铵、5 mmol/L甲酸铵(0.025%甲酸)、5 mmol/L甲酸铵(0.05%甲酸)、5 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸),实验表明,水相为0.1%甲酸溶液时,各峰型及分离度最佳。具体色谱图见图4。

图4 不同流动相比例时MRM色谱图Fig.4 MRM chromatogram with different mobile phase proportions注:A:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水;B:0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸铵;C:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸铵(0.025%甲酸);D:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸铵(0.05%甲酸);E:0.1%甲酸甲醇-5 mmol/L甲酸铵(0.1%甲酸)。

2.4 样品前处理方法优化

2.4.1 提取溶剂 鸡蛋的蛋黄和蛋清都是可食用部分,由于所分析的5类化合物极性不同,在蛋黄与蛋清中的分布不同,故需将两者混合均匀。药物残留分析常用溶剂包括乙腈-水-缓冲液、甲醇-水-酸、乙腈-水-酸等,乙腈对蛋白质有较强沉淀效果,故本研究比较了1.0%乙酸乙腈、1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈、70%的乙腈提取效果,结果表明,70%乙腈提取液最澄清,且无油脂漂浮,回收率依次为70%乙腈>1%甲酸乙腈>1.0%乙酸乙腈>5%甲酸乙腈,见表2,故选择70%乙腈作为提取溶剂,去除蛋白质等干扰物质。

表2 不同提取溶剂回收率Table 2 Recovery in different solvent

2.4.2 净化方法 本实验用MWCNTs、PSA、C18作为吸附剂。MWCNTs主要去除色素、糖等大分子物质,PSA可以去除酸性物质、糖类和碳水化合物,C18可以去除脂肪、油脂和非极性化合物[22]。

鸡蛋中富含蛋白质和脂肪,还有核黄素,这些杂质对目标化合物的测定产生较大干扰,首先考察了MWCNTs、PSA、C18对色素的吸附效果,在2 mL提取液分别加入50 mg MWCNTs、50 mg PSA和50 mg C18,实验表明,色素的吸附效果依次为MWCNTs>C18>PSA。由于MWCNTs的结构特性,在去除干扰物的同时也吸附目标化合物,因此本实验以回收率作为指标对MWCNTs的用量进行考察,当MWCNTs用量为10、20、50 mg时,氟虫腈类的回收率变化不大,氯霉素、抗病毒、磺胺、硝基咪唑类回收率随着MWCNTs用量的增加而减小,见图5,说明MWCNTs对目标化合物有一定的吸附作用。为除去鸡蛋中的脂肪、小极性化合物及其它对目标物测定带来干扰的物质,本实验分别考察了MWCNTs+PSA、MWCNTs+C18、MWCNTs+PSA+C18不同组合作为净化剂,结果表明MWCNTs+PSA+C18组合的净化效果最佳,基质干扰较小,回收率在70%～115%,满足检验要求。

图5 不同MWCNTs用量的回收率Fig.5 Recovery rates of different MWCNTs注:图中标注数字与表1中各数字所代表的化合物一致。

2.5 方法学验证

2.5.1 标准工作曲线 按1.2.2.3操作,结果R2为0.9909～0.9999,表明44种药物在0.1～200 ng/mL范围内线性良好,见表1。

2.5.2 检出限、检出限和定量限 基质混合标准溶液按1.2.3和1.2.4色谱和质谱条件进行测定,以浓度为X轴,峰面积为Y轴绘制标准曲线,44种药物的相关系数均大于0.991,说明方法线性良好,结果见表1。在空白样品中添加已知浓度的标准溶液,以3倍和10倍信噪比(S/N)分别计算44种药物的方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ),LOD为0.007～0.3571 μg/kg,LOQ为0.005～1.190 μg/kg,结果见表3。

表3 44种药物残留加标回收、精密度及LOD、LOQ(n=6)Table 3 Recovery,precision,LOD and LOQ of 44 drug residues(n=6)

2.5.3 回收率和精密度 取2.00 g样品,置于50 mL聚丙烯离心管中,分别添加0.02 mL 10 ng/mL、0.2 mL 100 ng/mL混合标准使用液和0.2 mL 500 ng/mL混合标准使用液,照1.2.1方法操作,得到加标溶液,分别对每个添加水平进行平行测试6次,计算平均回收率及相对标准偏差(RSD)。各化合物的回收率为77.9%～114.5%,符合多残留分析要求,见表3。

2.5.4 实际样品的测定 采用本研究方法对广西11个地市共82批次鸡蛋进行药物残留筛查,结果检出9批次鸡蛋含有磺胺甲基异恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、甲氧苄啶、地美硝唑、羟基甲硝唑、羟甲基甲硝唑、金刚烷胺和氟苯尼考,与国家标准或行业标准(GB/T 22338-2008 《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》、SN/T 4253-2015 《出口动物组织中抗病毒类药物残留量的测定 液相色谱-质谱 质谱法》、GB/T 21316-2007 《动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法》、SN/T 1928-2007 《进出口动物源性食品中硝基咪唑残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法》)方法测定结果进行比较,结果见表4,本方法与标准方法的相对标准偏差为1.4%～9.7%,表明本研究方法数据准确可靠。

表4 本方法与标准方法测定结果比较Table 4 Comparison of the results betweenthis method and the standard method

3 结论

本研究采用改进的多壁碳纳米管-QuEChERS方法建立了LC-MS/MS同时测定鸡蛋中氯霉素、氟虫腈、抗病毒、磺胺、硝基咪唑5类共44种药物残留量的高通量筛查方法,测定多类药物残留,简单快速,节约检验成本与检验周期,净化效果好,灵敏度、准确度和精密度高,弥补国家标准和行业标准分类检测的不足,适应日常大批量的鸡蛋中药物残留的监管,为兽药残留检测标准修订提供基础数据。