金佛手酵素发酵过程中有机酸及其体外抗氧化性能分析

方 晟,陈俊沲,周 瑾,沙如意,毛建卫,3,*

(1.绍兴文理学院元培学院,浙江绍兴 312000; 2.浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室,浙江杭州 310023; 3.浙江工业职业技术学院,浙江绍兴 312000)

食用植物酵素(Edible plant Jiaosu)是以新鲜蔬菜、水果、药食两用本草类为原料,经多种有益菌通过较长时间发酵而生产的功能性发酵产品,研究表明,酵素可有效清除体内过剩的活性氧自由基,在预防和治疗因自由基诱发的疾病和抗衰老方面具有广阔的应用前景[1-2]。食用植物酵素既保持了植物自身营养成分、也含有乳酸菌等有益微生物及其代谢产生的功能性小分子物质等,其中有机酸是一项重要指标,对酵素产品的特有风味及抗氧化等功能性作用有重要贡献[3-4]。目前酵素品类繁多,但品质差别大,且相关科学研究支撑不足,亟需深入开展食用植物酵素发酵过程功能组分和功效研究,进而用标准化手段规范传统工艺,保证酵素的品质。

佛手(CitrusmedicaL. var. sarcodactylis Swingle)为芸香科柑橘属植物香橼的1个变种,是国家卫计委公布的首批“药食同源”植物之一,现主要分布于浙江、四川、福建和广州等地,其中以浙江金华生产的金佛手最为著名,被称为“果中之仙品,世上之奇卉”,不仅含有黄酮、香豆素、氨基酸等活性成分,还含有琥珀酸等有机酸,药理实验表明,其具有抗肿瘤、降血糖、抗氧化、消炎等作用[5-6]。目前金佛手在功能性食品领域的深入开发较少,主要用于制作佛手茶、佛手酒、佛手果脯等,附加值相对较低[7]。从食用安全性和保健功效考虑,金佛手是开发食用植物酵素的优良植物资源,但目前未见关于金佛手酵素的研究报道。

本研究以金佛手为主要原料制备食用植物酵素,探讨对其自然发酵过程中体外抗氧化性能、有机酸组成及含量的变化规律,以期为金佛手酵素产品的开发及精准制备提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金佛手鲜果 金华汝来佛手有限公司;发酵糖液 浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室提供;α,α-二苯基-β-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)、吩嗪硫酸甲酯(Phenazine Methosulfate,PMS)、硝基四氮咪唑蓝(Nitrotetrazolium blue chloride,NBT)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(2,2′-Azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)、有机酸标准品(草酸、L-酒石酸、L-苹果酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、马来酸、没食子酸,均为分析纯,纯度≥99%) 美国Sigma公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris)、磷酸氢二钾、磷酸、甲醇、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、水杨酸钠、硫酸亚铁、盐酸 均为分析纯,上海展云化工有限公司。

LC-20A高效液相色谱仪 岛津公司;TU-1810紫外可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;PHS-3C酸度计 上海佑科仪器仪表有限公司;Allegra X-12R型冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司;SW-CJ-1B超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金佛手酵素的制备 参考程勇杰等[8]的方法,用去离子水清洗金佛手鲜果表面,去除杂质,自然晾干表面水分,将其切块后与发酵糖液按质量比3∶5混匀共6 kg,加入到已灭菌的10 L玻璃瓶中密封,25 ℃下避光发酵。发酵过程中,分别在第5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90 d取样,样品于10000 r/min离心10 min后,保留上清液待测。

1.2.2 超氧自由基清除率的测定 采用PMS/NADH体系还原NBT法[9],取1.2.1所述上清液50 μL加入到950 μL磷酸缓冲液(0.1 mol/L,pH7.4),然后加入1 mL 120 μmol/L的PMS(用0.1 mol/L的PBS配制,pH=7.4),1 mL 936 μmol/L的NADH(用0.1 mol/L的PBS配制,pH=7.4)和1 mL 300 μmol/L的NBT(用0.1 mol/L的PBS,pH=7.4配制)。在环境温度下反应5 min。以去离子水为参比溶液。在560 nm处测定吸光度。

超氧自由基清除率(%)

式中:A0为空白对照液吸光度;A1为样品测定管吸光度;A2为样品本底管吸光度。

1.2.3 羟基自由基清除率的测定 采用Fenton法[10],取1.2.1所述上清液335 μL加入到1.4 mL 6 mmol/L的H2O2,加入0.6 mL 20 mmol/L的水杨酸钠和2 mL 1.5 mmol/L的硫酸亚铁,37 ℃下恒温水浴1 h。以去离子水为参比溶液。在562 nm下测定吸光度。

羟基自由基清除率(%)

式中:A0为空白对照液吸光度;A1为样品测定管吸光度;A2为样品本底管吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除率的测定 采用DPPH甲醇溶液显色法[11],取1.2.1所述上清液40 μL加入到4 mL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液中,再加入450 μL 50 mmol/L的Tris-HCL buffer(pH=7.4),25 ℃下恒温水浴30 min。以去离子水为参比溶液。在517 nm处测定吸光度。

DPPH自由基清除率(%)

式中:A0为空白对照液吸光度;A1为样品测定管吸光度;A2为样品本底管吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除率的测定 采用ABTS过硫酸钾显色法[12],用7 mmol/L的ABTS(用5 mmol/L的PBS配制,pH=7.4),加入过硫酸钾,最终浓度为2.45 mmol/L,在室温下黑暗放置12～16 h。使用前把ABTS自由基用PBS稀释成在734 nm下吸光度为0.7±0.02。取1.2.1所述上清液10 μL加入到5 mL上述稀释液中,在30 ℃下反应5 min。以去离子水为参比溶液。在734 nm处测定吸光度。

ABTS自由基清除率(%)

式中:A0为空白对照液吸光度;A1为样品测定管吸光度;A2为样品本底管吸光度。

1.2.6 还原力的测定 采用铁氰化钾法[13],取1.2.1所述上清液30 μL加入到2.5 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L,pH=6.6),然后加入2.5 mL质量浓度1%铁氰化钾,50 ℃反应30 min,再加入质量浓度10%三氯乙酸2.5 mL,在3000 r/min下离心10 min,立即取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去离子水和0.5 mL质量浓度0.1%三氯化铁。以去离子水为参比溶液。在700 nm处测定吸光度。

1.2.7 有机酸含量的测定 有机酸含量的测定采用高效液相色谱法,参考Radrigo等[14]的方法进行。HPLC分离条件:色谱柱为Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.,5 μm),流动相为0.01 mol/L的KH2PO4溶液(用磷酸调pH=2.7),流速1 mL/min,柱温20 ℃,检测波长210 nm。1.2.1所述上清液用0.01 mol/L的KH2PO4溶液(pH=2.7)稀释5倍,0.22 μm微孔滤膜过滤后直接进样。

1.3 数据处理

全部试验均平行进行3次,试验结果表示为均值±标准差(Mean±SD)形式。采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析、聚类分析及相关性分析,采用Origin 86软件绘制图表。

2 结果与分析

2.1 金佛手酵素发酵过程中体外抗氧化活性的变化

2.1.1 发酵过程中超氧自由基清除率的变化 超氧自由基在活性氧物质如过氧化氢、单线态氧的形成中起重要作用,主要损害细胞膜,包括血管内皮细胞膜及亚微结构,并引起一系列有害的生化反应[15]。图1中,金佛手酵素的超氧自由基清除率在5～15 d迅速上升,随后基本保持稳定,直到60 d时上升到最高后下降,80～90 d显著上升(P<0.05),60 d时清除率达到94.39%,相较发酵5 d时提高19.33%。蒋增良等[16]研究发现葡萄酵素自然发酵过程中对超氧自由基的清除能力呈先增加后略微降低再增加的趋势,第56 d时达到最大,清除率为65.22%,相较发酵前增加了12.8%,与本实验研究结果相似。

图1 发酵过程中超氧自由基清除率的变化Fig.1 Change in superoxide radicalscavenging rate during fermentation注:不同字母表示差异显著(P<0.05);图2～图5同。

2.1.2 发酵过程中羟基自由基清除率的变化 羟基自由基是生物体内极具反应性的自由基,它几乎能与活细胞中任何生物大分子发生反应,且反应速度极快,在自由基病理学上被认为具有高度的损伤性[10,17]。图2表明,金佛手酵素的羟基自由基清除率在5～20 d之间快速提升(P<0.05),之后呈缓慢上升的趋势,在发酵90 d时达到最高,为54.16%,相较发酵5 d时提高了270.64%。说明延长发酵时间有利于金佛手酵素对羟基自由基清除率的提高。包永春[18]发现乳酸、苹果酸和酒石酸均具有清除羟基自由基的能力;也有研究表明酵母壁上多糖具有一定的羟基自由基清除能力[17];因此金佛手酵素羟基自由基清除能力的提高可能是有机酸、多糖等物质综合作用的结果。

图2 发酵过程中羟基自由基清除率的变化Fig.2 Changes in hydroxyl radicalscavenging rate during fermentation

2.1.3 发酵过程中DPPH自由基清除率的变化 DPPH是一种稳定的有机氮自由基,在乙醇溶液中显深紫色,能吸收抗氧化物的电子而引起样品颜色的改变,其褪色程度与接受电子数成正比[19]。DPPH自由基清除能力是评价抗氧化性能的常用方法,实验验证其具有良好的敏感性[20]。如图3所示,金佛手酵素的DPPH自由基清除率在发酵过程中呈先上升后下降,再缓慢上升的变化(P<0.05),发酵20 d时清除率最高,达到60.90%,相较发酵5 d时提高了42.08%。张巧等[21]研究表明大果山楂酵素在自然发酵过程中DPPH自由基清除率呈先上升后下降的变化趋势,在20 d时达到峰值,为84.11%,与本研究结果类似。

图3 发酵过程中DPPH自由基清除率的变化Fig.3 Changes in DPPH radicalscavenging rate during fermentation

2.1.4 发酵过程中ABTS自由基清除率的变化 由图4可知,金佛手酵素发酵过程中ABTS自由基清除率总体呈缓慢上升趋势,发酵70 d时清除率最高,达到40.09%,相较发酵5 d时提高了30.10%。蒋增良等[16]研究发现葡萄酵素的ABTS自由基清除率在自然发酵过程中一直呈上升趋势,在56 d后达到最高的68.48%,与未发酵之前相比提高了17.2%。ABTS自由基是一种过氧化氢酶的底物,蒋增良等[4]研究表明:有机酸、维生素和酚类物质具有清除ABTS自由基的能力,其作用取决于分子质量、芳香环数量和羟基取代基等。

图4 发酵过程中ABTS自由基清除率的变化Fig.4 Change in ABTS radicalscavenging rate during fermentation

2.1.5 发酵过程中还原力的变化 还原力的大小不仅与自由基的清除有关,还与过氧化物降解等因素有关[8]。从图5可见,金佛手酵素发酵过程中还原力的变化趋势与DPPH自由基清除率相似,呈先上升后降低,再缓慢上升的变化。发酵15 d时去除率最高,达到0.619,相较发酵5 d时提高了21.52%。郭艳萍等[22]对葡萄酵素进行研究,发酵过程中还原力在18 d时达到峰值后下降,之后又呈上升趋势,与本研究结果相似。

图5 发酵过程中还原力的变化Fig.5 Change in reducing power during fermentation

2.2 金佛手酵素发酵过程中有机酸的变化

图6为有机酸标准品HPLC色谱图,图7为发酵90 d时金佛手酵素样品有机酸HPLC色谱图,由图6、图7可知,金佛手酵素中有机酸组成丰富,包括草酸、L-酒石酸、L-苹果酸、莽草酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸,马来酸和没食子酸未检出。

图6 有机酸标准品的HPLC色谱图Fig.6 HPLC Chromatograms of organic acids standard注:1为草酸;2为L-酒石酸;3为L-苹果酸;4为莽草酸;5为抗坏血酸;6为乳酸;7为乙酸;8为柠檬酸;9为琥珀酸;10为马来酸;11为没食子酸;图7同。

图7 发酵90 d金佛手酵素样品有机酸的HPLC色谱图Fig.7 Organic acids HPLC chromatogram ofcitrus bergamot Jiaosu after 90 d fermentation

由表1可见,金佛手酵素的总有机酸含量呈先上升后下降再上升的趋势,发酵90 时达到最高,为(9.600±0.12) mg/mL,相较发酵5 d时增长105.48%。其中,乙酸、乳酸、L-酒石酸、草酸含量在发酵过程中的变化趋势与总有机酸含量相似,发酵90 d分别达到(3.212±0.02)、(3.294±0.10)、(1.668±0.02)和(0.879±0.01) mg/mL,显著高于发酵5 d时的含量(P<0.05),其增幅分别为3080.20%、431.29%、20750.00%和109.29%。而L-苹果酸、柠檬酸、莽草酸和抗坏血酸含量在发酵过程中总体呈下降趋势,琥珀酸含量呈先升高后降低变化。

表1 金佛手酵素发酵过程中有机酸含量变化Table 1 Changes in contents of organic acid in Citrus medica Jiaosu during fermentation

发酵5～15 d期间,金佛手酵素的主要有机酸为柠檬酸和L-苹果酸,发酵15 d时占总有机酸含量的75.05%;发酵40～90 d期间主要有机酸为乳酸、乙酸和L-酒石酸,发酵90 d时占总有机酸含量的85.15%。发酵各时段不同有机酸含量平均值排序为:乳酸>乙酸>柠檬酸>L-酒石酸>L-苹果酸>草酸>琥珀酸>抗坏血酸>莽草酸。

发酵过程中乳酸、乙酸等的累积以及柠檬酸、L-苹果酸的消耗可能主要与产酸微生物的代谢有关。目前,从食用植物酵素自然发酵过程中分离得到的优势菌种主要为酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等[23]。酵母菌通过糖降解途径和三羧酸循环,在生长期可产生大量有机酸[24];醋酸菌在糖源充足的情况下可直接利用葡萄糖生成乙酸,或将酵母菌代谢产生的乙醇转化为乙酸[2,25];乳酸菌通过糖代谢生成乳酸,在厌氧条件下还可将乳酸氧化转化为乙酸[26]。L-苹果酸、柠檬酸和莽草酸是三羧酸代谢循环的中间物质,在乳酸菌等作用下被大量消耗,而抗坏血酸因不稳定可能被氧化,因此在发酵过程中均不容易累积[27-29]。Zeinab等[30]用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵石榴,发酵过程中,柠檬酸的含量逐渐降低,而乳酸、乙酸和丙酸随着发酵时间的延长,其含量逐渐增加,与本实验研究结果一致。沙如意等[31]研究同样发现火龙果酵素发酵过程中乳酸和乙酸含量增加明显,其中乳酸从发酵初期的5.21 mg/mL增加到40 d时的7.89 mg/mL,提高了51.44%,之后乳酸的含量变化缓慢。马晓娟[32]用植物乳杆菌发酵胡萝卜原浆,发现随着发酵时间的延长,乳酸的含量逐渐增加,苹果酸的含量逐渐减低。

2.3 发酵过程中有机酸变化时间特性的聚类分析

采用类间平均链锁法(Between groups linkage)对金佛手酵素不同发酵时间的有机酸含量进行聚类分析,结果如图8所示,在欧式平方距离15处,12个不同发酵时间的金佛手酵素样品可以聚为二类。第1类发酵阶段为5～15 d,其特点是酵素中柠檬酸和L-苹果酸含量较高,可能是发酵初期由微生物代谢产生的有机酸较少,有机酸主要源自植物材料中水溶性有机酸的溶出[8];第2类发酵阶段为20～90 d,其特点是乳酸、乙酸和L-酒石酸含量较高,可能是因为随着植物材料的降解,环境中的营养物质更为丰富,产酸微生物如乳酸菌、醋酸菌等大量繁殖而生成乳酸等次生代谢产物[23,33]。

图8 金佛手酵素发酵时间聚类树状图Fig.8 Dendrogram obtained from clustering analysis offermentation time of Citrus medica Jiaosu

2.4 发酵过程中有机酸种类特性的聚类分析

对金佛手酵素发酵过程不同种类有机酸进行聚类分析,结果见图9,在欧式平方距离15处,9种有机酸可以分为三类。第1类由乙酸、乳酸、L-酒石酸和草酸组成,聚入此类的有机酸发酵过程中呈先上升后下降再上升的变化趋势;第2类由L-苹果酸、柠檬酸、莽草酸和抗坏血酸组成,其特点是随发酵进行总体呈下降趋势;第3类为琥珀酸,其含量呈先升高后降低的变化。

图9 金佛手酵素有机酸种类聚类树状图Fig.9 Dendrogram obtained from clustering analysis oforganic acid species of Citrus medica Jiaosu

2.5 有机酸含量与体外抗氧化活性的相关性

根据表2,金佛手酵素发酵过程中羟基自由基清除率与乳酸和乙酸含量呈极显著正相关(P<0.01),相关系数分别达到0.885和0.810,而与草酸和L-酒石酸含量为显著正相关(P<0.05);超氧自由基清除率与乳酸含量具有显著正相关(P<0.05),相关系数达到0.689,说明发酵过程中乳酸对金佛手酵素抗氧化性能有一定作用;DPPH自由基清除率与琥珀酸呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.786;ABTS自由基清除率与还原力与各种有机酸含量无显著相关关系,金佛手酵素中可能存在黄酮类等活性物,也会对抗氧化剂起到协同或者增效的作用。乳酸、乙酸含量与L-苹果酸、柠檬酸和莽草酸含量均呈极显著的负相关(P<0.01),随着发酵进行,L-苹果酸、柠檬酸和莽草酸可能参与代谢被产酸微生物利用生成乳酸和乙酸。

表2 有机酸与抗氧化活性之间的相关系数Table 2 Correlation coefficients between organic acids and antioxidant activity

3 讨论与结论

本研究结果表明,随着发酵时间的延长,金佛手酵素体外抗氧化性能总体呈上升趋势,因此有必要进一步延长发酵时间,考察其抗氧化性能的变化。国内外学者对葡萄、火龙果、竹叶等果蔬或中草药制备的酵素进行研究,结果表明发酵过程能够提高酵素对自由基的清除能力,与本研究结果一致[16,23,31]。酵素发酵过程抗氧化性能的上升变化可能与高糖浓度下原料中抗氧化物质溶出以及微生物代谢有关,郭艳萍等[22]、薛淑龙等[23]、陈小伟等[25]分别对葡萄酵素、咖啡果皮酵素和竹叶酵素天然发酵过程自由基清除能力进行分析,均发现其变化与总酚含量有明显的正相关性,王益莉等[17]认为苹果酵素发酵过程羟基自由基清除能力的变化受到酵母数量的影响;蒋增良等[4]研究表明葡萄酵素对自由基的良好清除能力可能是基于有机酸、多酚、维生素和SOD酶的协同作用;沙如意等[31]发现火龙果酵素发酵过程中莽草酸和乙酸与ABTS自由基清除能力呈正相关;程勇杰等[8]发现柘树酵素抗氧化性能与氨基酸含量具有正相关性。相关性分析结果显示,金佛手酵素发酵过程中乳酸含量变化与体外抗氧化性能具有显著的正相关性。金佛手原料中的黄酮、多糖以及挥发油等都具有一定的抗氧化作用,因此有必要对金佛手酵素发酵过程有机酸与黄酮和多糖等联合抗氧化作用进行研究。

本研究对金佛手酵素发酵过程有机酸组成及含量变化进行分析,结果表明,发酵90 d时金佛手酵素的总有机酸含量显著提高,发酵阶段有机酸组成丰富,发酵5～15 d之间以L-苹果酸和柠檬酸为主,发酵40～90 d期间以乳酸、乙酸和L-酒石酸为主,此外还含有莽草酸、抗坏血酸、琥珀酸和草酸。各种有机酸含量变化趋势不同,聚类分析将其归为3类,而将发酵过程归为2类,较好地反映出发酵过程中各类有机酸的差异性。研究表明,有机酸对食用植物酵素的抗氧化性能有重要作用,且有机酸有利于人体肠道上皮细胞的生长与发育、促进肠道健康[4]。张梦梅等[26]对市售酵素进行研究发现,发酵期酵素中广泛存在酵母菌、乳酸菌和醋酸菌,主要有机酸为草酸、苹果酸、乳酸和乙酸。食用植物酵素的传统制备工艺主要采用自然发酵,自然发酵属混菌发酵过程,酵素中乳酸等有机酸的生成可能主要来自于微生物的糖代谢,也有部分来自于多元醇的代谢。因此,有必要对金佛手酵素开展基于高通量测序技术的发酵过程微生物整体群落结构及演替规律研究,明确对有机酸变化起主导作用的核心微生物菌群,为金佛手酵素发酵阶段的理性监测及调控方法提供理论基础。