重金属离子对耶氏解脂酵母油脂积累量及柠檬酸分泌量的影响

张鲁宁,宋元达,张怀渊,*

(1.山东理工大学农业工程与食品科学学院,山东淄博 255000; 2.上海科技管理干部学院,上海 201800)

耶氏解脂酵母(Yarrowialipolytica)是一种产油产酸酵母,于1942年被首次分离得到[1]。在一定条件下,耶氏解脂酵母能将碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂等碳源转化为微生物油脂(microbial oil),可用于合成生物柴油(biodiesel),缓解日益严重的环境问题和能源安全问题。经基因工程改造的耶氏解脂酵母也可生产功能性脂肪酸,如α-亚麻酸[2]、二十碳五烯酸(EPA)[3]、共轭亚油酸(CLA)[4]等。此外,耶氏解脂酵母能够利用糖类、乙醇和醋酸等发酵产生并大量分泌柠檬酸(citric acids)[5]。柠檬酸在食品饮料与药品两大领域应用广泛,全球柠檬酸需求稳增,亚太地区尤其是中国柠檬酸市场增长率高。近年来耶氏解脂酵母已被考虑作为柠檬酸生产的潜在菌种而成为研究的热点[6-8]。

微生物油脂合成和柠檬酸分泌有着相近的代谢途径(图1)[9-11]。大量研究表明,耶氏解脂酵母油脂合成和柠檬酸积累之间的代谢转化与营养限制培养基(如氮、磷、镁)或培养条件(如生长情况、含氧量、pH或温度)有关[7]。在细胞内氮源缺乏时,腺苷一磷酸(AMP)浓度下降,TCA循环途径中的异柠檬酸脱氢酶活性受到抑制,导致上游的异柠檬酸和柠檬酸大量积累,线粒体内积累的大量柠檬酸经过线粒体膜上柠檬酸转运蛋白(mitochondrial citrate transporter,mCT)被转运到细胞质中,这个过程是油脂合成和柠檬酸分泌两者共有的。随后进入细胞质的柠檬酸有两条代谢路径,一条是柠檬酸被ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase,ACL)裂解生成乙酰辅酶A用于脂肪酸合成。另一条是柠檬酸被细胞膜上柠檬酸转运蛋白(cytoplasmic citrate transporter,cCT)转运到细胞外。由此可见,柠檬酸是糖酵解与油脂合成的重要连接物,柠檬酸在整个油脂积累过程中占据着重要地位。

图1 酵母油脂合成和柠檬酸分泌的代谢途径[7,9-11]Fig.1 Metabolism pathway of oil synthesisand organic acid secretion in yeast[7,9-11]注:mCT:mitochondrial citrate transporter,线粒体膜上柠檬酸转运蛋白;cCT:cytoplasmiccitrate transporter,细胞膜上柠檬酸转运蛋白。

重金属离子会影响微生物产油产酸。过量重金属离子Cu2+和Cd2+能抑制Aspergillusniger的生长和柠檬酸分泌[12]。而Mn2+、Mg2+、Fe2+和Zn2+则能促进Aspergillusniger柠檬酸分泌[13-14]。为了探究重金属离子对耶氏解脂酵母产油产酸的影响,本研究选取了11种重金属离子,通过测定生物量、细胞外柠檬酸含量、油脂含量及脂肪酸组成等指标,从中筛选出对耶氏解脂酵母产油产酸影响相对显著的重金属离子,并进一步研究了不同浓度梯度下的此类重金属离子对耶氏解脂酵母油脂含量和柠檬酸分泌的影响。为进一步探究产油微生物油脂积累和柠檬酸分泌两者代谢路径间的生化关系打下铺垫,为今后寻求微生物油脂及柠檬酸的工业生产提供理论帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

耶氏解脂酵母YarrowialipolyticaCICC1778(ATCC 20460) 中国工业微生物菌种保藏中心;葡萄糖、ZnCl2、CaCl2、CuCl2、CoCl2·6H2O、CrCl3·6H2O、NiCl2、MnCl2、MgCl2·6H2O、FeCl2·4H2O、FeCl3、AlCl3、NaCl、HCl、硫酸铵、丙三醇、甲醇、三氯甲烷 均为分析纯,国医药(集团)上海化学试剂公司;正己烷(色谱纯) 国医药(集团)上海化学试剂公司;酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid公司;无氨基酵母氮源(Yeast Nitrogen Base Without Amino acids,YNB) 生工工程(上海)股份有限公司;脂肪酸标准品、柠檬酸标准品 Sigma公司。

SW-CJ-1FD型超净工作台 上海智诚仪器厂;MLS-3750型灭菌锅 SANYO Electric Co.,Ltd;ZHWY-2102型回转式恒温摇床 上海智城分析仪器制造有限公司;EL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;PB3002-N型分析电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;4K15型高速冷冻离心机 上海博鑫仪器有限公司;DK-8D型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司;Thermo707型超低温冰箱 REVCO;QSC-12T 型氮吹仪 上海泉岛公司;GC 2010 型气相色谱仪 日本岛津制造所;Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent Technologies公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基配制

1.2.1.1 种子培养基 葡萄糖20 g/L,酵母提取物10 g/L,蛋白胨20 g/L。分装成50 mL/瓶,115 ℃灭菌20 min。

1.2.1.2 产脂产酸培养基 甘油100 g/L,YNB 1.7 g/L,(NH4)2SO41.0 g/L。分装成50 mL/瓶,115 ℃灭菌20 min。

1.2.2 重金属离子溶液配制 根据金属离子氯化物的溶解度,分别称取适量的ZnCl2、CaCl2、CuCl2、CoCl2、CrCl3固体配制成0.5 mol/L的水溶液;分别称取适量的NiCl2、MnCl2固体配制成1.0 mol/L的水溶液;称取适量的MgCl2固体配制成0.3 mol/L的水溶液,115 ℃灭菌20 min。分别称取适量FeCl2、FeCl3、AlCl3固体配制成0.5 mol/L的水溶液,过滤灭菌。

1.2.3 菌种培养 从保菌管中取100 μL含有30%(w/V)甘油的菌液,加入种子培养基,在28 ℃ 200 r/min摇床中培养24 h;收集1 mL菌液于1.5 mL离心管中,于5000 r/min下离心5 min,弃上清,超净台内取少量产脂产酸培养基吹吸菌体沉淀,使其再次悬浮,然后转移至产脂产酸培养基内,在28 ℃ 200 r/min摇床中培养80 h。

1.2.4 重金属离子类型对耶氏解脂酵母的影响 在产脂产酸培养基(50 mL)中,分别加入终浓度为2 mmol/L的Zn2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Cr3+11种重金属离子,发酵培养80 h,以无重金属离子添加的空白组为对照组,测定生物量、柠檬酸含量、油脂含量及脂肪酸组成等指标,筛选出对耶氏解脂酵母油脂含量和柠檬酸分泌量有影响的重金属离子。

1.2.5 不同浓度梯度的重金属离子对耶氏解脂酵母的影响 将筛选出的Mn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+4种重金属离子分别设置成不同的浓度梯度:Mn2+:0(对照)、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L;Co2+:0(对照)、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L;Cu2+和Ni2+:0(对照)、0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L。发酵培养80 h,测定生物量、柠檬酸含量、油脂含量及脂肪酸组成等指标,探究不同浓度梯度的重金属离子对耶氏解脂酵母的影响。

1.2.6 菌体收集及生物量测定 菌体收集及生物量测定参照林义等[15]方法。量取4 mL培养80 h后的菌液于5 mL离心管(事先烘干称重m1,g)中,在4000 r/min下,离心3 min,弃上清,用4 mL去离子水洗涤沉淀,在4000 r/min下离心3 min,弃去上清,沉淀冷冻干燥后称重m2(g)。

生物量(g/L)=(m2-m1)×250

式(1)

1.2.7 脂质提取及脂肪酸甲酯化 脂质提取及脂肪酸甲酯化参照Papanikolaou等[16]方法。量取2 mL培养80 h后的菌液于提脂瓶中,在4000 r/min下离心3 min,弃去上清,用4 mL去离子水洗涤沉淀,在4000 r/min下离心3 min,弃去上清,沉淀用于提取脂质。

1.2.7.1 脂质提取 加入2 mL 4 mol/L的HCl溶液,80 ℃水浴3 h。水浴结束后,冷却至室温,加入1 mL甲醇、2 mL氯仿和100 μL标样C15∶0,震荡30 min,在3000 r/min下离心3 min,下层液体移至新玻璃瓶,氮气吹干。

1.2.7.2 甲酯化 氮吹后加入1 mL 10%盐酸-甲醇溶液,60 ℃水浴3 h。水浴结束后加入1 mL饱和NaCl溶液、2 mL正己烷,在3000 r/min条件下离心3 min,取1 mL上层清液移入气相瓶。

1.2.8 脂肪酸含量测定 肪酸含量测定参照陈海元等[17]方法。使用气相色谱仪对样品进行检测,气相色谱柱为 DB-WAX column(30 m×0.32 mm,0.22 μm),氢离子火焰(FID)检测器,载气为氢气,流量为40 L/min,检测条件为:检测器温度为260 ℃,进样口温度为240 ℃,进样量为1 μL,分流比15.4∶1,柱升温程序为120 ℃保持3 min,以5 ℃/min的速率升温至190 ℃,再以4 ℃/min的速率升温至220 ℃,保持2 min。使用内标法(C15∶0)根据气相图中色谱峰的出峰时间和峰面积进行脂肪酸分析。

油脂含量(%)=油脂质量(W1,mg)/细胞干重(W2,mg)×100

式(2)

1.2.9 柠檬酸含量测定 柠檬酸含量测定参照Papanikolaou等[16]方法。量取1.5 mL培养80 h后的菌液于离心管中,在12000 r/min下离心5 min,取1 mL上层清液移入液相瓶。使用高效液相色谱仪对样品进行检测,色谱柱为:Ecosil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为:甲醇/水/磷酸=5∶95∶0.05,流速为0～8 mL/min,柱温为30 ℃,检测器为UV-210 nm,进样量为10 μL。以已知浓度的柠檬酸的标准样品作为参比,计算各样品的柠檬酸的浓度。

1.3 数据处理

每组实验3个重复,结果以平均值±标准差(X±SD)表示。试验数据采用SPSS统计软件(V16.0)进行统计分析,多组数据比较时,采用ANOVA进行Duncan’s多重比较进行差异分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 重金属离子类型对耶氏解脂酵母产脂产酸的影响

在重金属离子终浓度为2 mmol/L的环境中,探索并鉴定了Zn2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+、Cr3+11种重金属离子对耶氏解脂酵母油脂积累量和柠檬酸分泌量的影响(表1)。Cu2+和Ni2+明显抑制其生物量,与对照组相比,生物量分别下降了86%和73%。Mn2+促进柠檬酸分泌,相比于对照组柠檬酸分泌量增加了83%;Cu2+、Ni2+、Cr3+和Fe3+则抑制柠檬酸分泌,与对照组相比,柠檬酸分泌量分别下降了95%、81%、80%和76%。Cu2+、Ni2+明显抑制其油脂积累,相比于对照组油脂含量分别下降了81%和65%。不同类型重金属离子影响耶氏解脂酵母脂肪酸组成见表2，Cu2+和Ni2+使C18∶2的组成比明显增多,C18∶0的组成比大幅减少;Co2+明显降低了C18∶1的组成比,Cr3+增加了C18∶1的组成比;Fe2+降低了C18∶0的组成比。

表1 重金属离子对耶氏解脂酵母的生物量、柠檬酸分泌量和油脂含量的影响Table 1 Effect of heavy metal ions on biomass,citric acidsecretion and lipid contents in Yarrowia lipolytica

综上分析,Cu2+、Ni2+对生长有明显的抑制作用,也严重影响了柠檬酸分泌量和油脂积累量;同时也促进了脂肪酸不饱和度的增加;Co2+增加了饱和脂肪酸的组成比;Mn2+对柠檬酸分泌有明显的促进作用。

2.2 不同浓度梯度的Mn2+、Co2+、Cu2+、Ni2+对耶氏解脂酵母产脂产酸的影响

2.2.1 Mn2+对耶氏解脂酵母油脂积累量及柠檬酸分泌量的影响

如图2所示,不同浓度的Mn2+对耶氏解脂酵母生物量没有显著影响(各实验组生物量约10 g/L);对油脂积累量有一定的促进作用,但未表现出明显的浓度梯度效应,Mn2+在1.0和2.5 mmol/L时,油脂含量分别达到峰值(17.6%和17.2%);Mn2+对柠檬酸分泌的促进作用与浓度梯度有一定的规律,随着Mn2+浓度升高,柠檬酸分泌量呈现先增加后减少趋势,在2.0 mmol/L左右,柠檬酸的分泌量达到最大值(6.9 g/L)。不同浓度的Mn2+对耶氏解脂酵母脂肪酸组成无明显影响,各浓度梯度之间的脂肪酸组成比无规律(表3)。

表3 不同浓度Mn2+对耶氏解脂酵母脂肪酸组成的影响Table 3 Effect of different concentrations of Mn2+ on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica

图2 不同浓度Mn2+对耶氏解脂酵母生物量、油脂含量及柠檬酸分泌的影响Fig.2 Effect of different concentrations of Mn2+ on biomass,lipid contents and citric acid secretion in Yarrowia lipolytica注:不同小写字母表示同一指标不同浓度之间差异显著,P<0.05;图2～图5同。

综上分析,Mn2+对耶氏解脂酵母的生长情况及脂肪酸组成无明显影响,但适宜浓度下会促进油脂积累与柠檬酸分泌。

2.2.2 Co2+对耶氏解脂酵母油脂积累量及柠檬酸分泌量的影响 如图3所示,相比于对照组,Co2+的添加会抑制耶氏解脂酵母的生长,但与浓度梯度之间未呈现明显关系。低浓度Co2+(0.5 mmol/L)对油脂积累和柠檬酸分泌有一定的促进作用;随着Co2+浓度增加,油脂含量与浓度梯度之间无明显规律,但柠檬酸分泌量随浓度增加而减少,在2.0 mmol/L时柠檬酸分泌量相比于对照组抑制了43%。表4中Co2+明显增加了C18∶0组成比,明显减少了C16∶1、C18∶1组成比,但与浓度梯度之间无规律。Co2+是否通过抑制Δ9-脂肪酸去饱和酶阻碍Δ9位上双键的形成而降低C16∶1、C18∶1组成比有待研究。

图3 不同浓度Co2+对耶氏解脂酵母生物量、油脂含量及柠檬酸分泌的影响Fig.3 Effect of different concentrations of Co2+ on biomass,lipid contents and citric acid secretion in Yarrowia lipolytica

表4 不同浓度Co2+对耶氏解脂酵母脂肪酸组成的影响Table 4 Effect of different concentrations of Co2+ on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica

综合分析,Co2+抑制耶氏解脂酵母的生长,低浓度Co2+(0.5 mmol/L)对油脂积累及柠檬酸分泌有一定的促进作用,高浓度条件下(≥1.0 mmol/L)对柠檬酸分泌有明显的抑制效果;Co2+的添加促使饱和脂肪酸含量上升,单不饱和脂肪酸含量下降。

2.2.3 Cu2+对耶氏解脂酵母油脂积累量及柠檬酸分泌量的影响 Cu2+对生物量、柠檬酸和油脂含量均有不同程度的抑制,而高浓度的Cu2+(>1.0 mmol/L)能够完全抑制酵母细胞柠檬酸的分泌,而低浓度的Cu2+(≤0.5 mmol/L)对油脂含量和柠檬酸分泌无明显的抑制,但高浓度的Cu2+(1.0 mmol/L)则表现出强烈的抑制作用,其油脂积累量相比于对照组下降了94%,已基本抑制了耶氏解脂酵母的油脂积累;同时柠檬酸分泌也几乎被完全抑制(图4)。即在耶氏解脂酵母中,过量的Cu2+既抑制了柠檬酸的分泌,也影响了油脂积累。研究表明,过量金属离子Cu2+虽然抑制了Aspergillusniger的生长和柠檬酸分泌,但是细胞中脂质和多糖含量大大增加[12]。两者不同表现对应的机理有待解析。Cu2+降低了C18∶0组成比,增加了C18∶2组成比。随着Cu2+浓度的增加,C18∶0组成比明显降低,C18∶2组成比大幅增加。同时,高浓度的Cu2+(≥0.75 mmol/L)也使得C18∶1组成比大幅减少。当Cu2+浓度达到1.0 mmol/L,C18∶2组成比相比于对照组增加了近4.6倍(表5)。高浓度Cu2+是否可以促进C18∶0、C18∶1向C18∶2的转化及其机制有待探究。

图4 不同浓度Cu2+对耶氏解脂酵母生物量、油脂含量及柠檬酸分泌的影响Fig.4 Effect of different concentrations of Cu2+ on biomass,lipid contents and citric acid secretion in Yarrowia lipolytica

表5 不同浓度Cu2+对耶氏解脂酵母脂肪酸组成的影响Table 5 Effect of different concentrations of Cu2+ on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica

综合分析,Cu2+对耶氏解脂酵母的生长情况具有明显抑制作用,低浓度条件下对油脂积累及柠檬酸分泌的影响不明显,高浓度对两者均表现出明显的抑制作用。

2.2.4 Ni2+对耶氏解脂酵母油脂积累量及柠檬酸分泌量的影响 如图5,Ni2+对耶氏解脂酵母生长的抑制作用不明显。油脂含量虽受到Ni2+的抑制,但是与浓度无明显相关性。柠檬酸分泌量随着Ni2+浓度增加表现出先上升后下降的趋势,在0.5 mmol/L时柠檬酸分泌量达到最大值(5.2 g/L),相比对照组增加了37%。随着Ni2+浓度升高,C16∶0、C18∶0组成比明显降低,C18∶1组成比有所增加。当Ni2+浓度为1.0 mmol/L时,相比对照组,C16∶0组成比下降了42%,C18∶1组成比增加了21%(表6)。

表6 不同浓度Ni2+对耶氏解脂酵母脂肪酸组成的影响Table 6 Effect on fatty acid profile in Yarrowia lipolytica under different concentrations of Ni2+

图5 不同浓度Ni2+对耶氏解脂酵母生物量产脂量及柠檬酸分泌的影响Fig.5 Effect on biomass,lipid contents and citric acid secretionin Yarrowia lipolytica under different concentrations of Ni2+

综合分析,Ni2+对耶氏解脂酵母的生长和油脂积累量有一定的抑制作用,与浓度梯度无明显相关性;柠檬酸分泌量与浓度梯度有一定的相关性,随浓度增加表现为先增加后减少的趋势,在0.5 mmol/L柠檬酸分泌量达到最大值(5.2 g/L)。

3 讨论与结论

产油产酸微生物是获取微生物油脂和柠檬酸等有机酸的重要来源,在食品药品中具有广泛应用价值[18-21]。认识和调控微生物油脂合成和柠檬酸分泌代谢途径,具有重要的理论与现实价值。柠檬酸是糖酵解与油脂合成的重要连接物。柠檬酸转运时会特异性的选择金属离子先形成柠檬酸盐络合物,后通过转运蛋白进行转运[9]。Streptococcus突变菌株的柠檬酸转运系统依托Fe3+进行转运,柠檬酸先与Fe3+形成柠檬酸盐,后依托转运蛋白进行转运[22];E.faecalis转运柠檬酸则依托Ca2+、Sr2+、Mn2+、Cd2+和Pb2+[14]。耶氏解脂酵母柠檬酸转运蛋白特异性选择何种重金属离子优先络合有待验证。此外,过量金属离子Cu2+对Aspergillusniger和Yarrowialipolytica生长、柠檬酸分泌量和油脂积累量影响的不同表现对应的机理有待解析。Co2+是否通过抑制Δ9-脂肪酸去饱和酶阻碍Δ9位上双键的形成而降低C16∶1和C18∶1组成比、高浓度Cu2+是否可以促进C18∶0和C18∶1向C18∶2的转化及其机制等仍有待探究。