超声波辅助不同吸附剂吸附蓝莓渣花色苷效果的比较

陈 涵,陶 阳,吴 越,罗鑫涛,韩永斌

(南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095)

蓝莓(Vacciniumspp.),为杜鹃花科、越橘属被子植物的浆果,具有多种营养和保健功能。蓝莓中含有多酚类(如花色苷)、熊果酸等生物活性成分,具有保护视力、抗氧化、预防和治疗心血管疾病等保健功能[1]。蓝莓常被制成果汁和酒,在加工过程中产生的蓝莓渣常被当作加工废弃物丢弃,不仅造成资源的浪费,也成为一种环境污染物。因此,采用合适的方法将蓝莓渣中功能性成分提取出来,对于保护环境、资源再利用及蓝莓产业的可持续发展具有重要意义。

花色苷是蓝莓及其渣中的主要功能性物质[2]。对植物提取物中的活性成分进行富集和纯化是工业化生产的关键步骤[3],常用的纯化手段有柱层析技术[4]、高效液相色谱技术[5]等。这些方法代价较高,不利于大量制备花色苷的精提物,因此需要更为简单、廉价的提纯工艺。吸附已被大量研究证实是一种有效的花色苷提纯方法,常用于酚类吸附的吸附剂有活性炭、天然矿物(如硅质材料、粘土和天然沸石)、树脂、生物吸附剂(如酵母、乳酸菌)等[6]。Yang等[7]研究了9种大孔树脂对覆盆子中花色苷的分离纯化,结果表明,在所选大孔树脂中,AB-8大孔树脂对花色苷的吸附和解吸性能最好;Luís等[8]研究了不同理化性质的活性炭对红酒进行处理后红酒中酚类化合物的变化,结果表明活性炭对红酒中酚类化合物有一定的吸附能力;Rizzo等[9]使用高效液相色谱法测定了酵母吸附的酚类物质,并阐明了酵母与葡萄中特定酚类物质相互作用的机理;Marsal等[10]使用有机膨润土吸附含羞草提取物中多酚,结果表明有机膨润土可以有效除去废水中多酚。

作为一种常见的非热加工技术,超声波被广泛应用于强化食品加工传质过程,如提取[11]、吸附[12]等过程。有研究表明,超声波可以提高吸附能力,其主要机理是超声空穴效应引起的一系列物理化学变化,包括气泡的形成与破裂,形成表面空隙等[13]。Wang等[12]发现超声波可以促进树脂XAD-16对苹果皮多酚的吸附与解吸过程,还能增强树脂的吸附能力。Tao等[14]研究表明超声波能增强废弃酵母对果渣提取物中酚类的吸附。但是,超声波对不同类型的吸附剂吸附性能的影响可能存在差异,因此,有必要比较不同种类吸附剂在超声波作用下吸附花色苷的特性。

本研究选取了大孔树脂XAD-7HP、酿酒酵母、活性炭、膨润土这四种常见的花色苷吸附剂,将其用于吸附蓝莓渣花色苷,比较超声波辅助与水浴振荡条件对花色苷吸附过程的影响,进而进行动力学方程拟合,并通过红外光谱鉴定不同吸附剂中参与吸附过程的官能团,旨在筛选出较适合用于超声波强化蓝莓渣花色苷吸附的吸附剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝莓(品种‘Garden blue’) 江苏省南京市溧水蓝莓种植基地,榨汁得到的蓝莓渣于-18 ℃贮藏;大孔树脂(20～60目,XAD-7HP) Solarbio技术有限公司;啤酒活性干酵母 安琪酵母股份有限公司;活性炭 南京寿德实验器材有限公司;膨润土 上海试四赫维化工有限公司;溴化钾(光谱纯) 上海源叶生物科技有限公司;其他试剂 均为分析纯。

IR100傅里叶变换红外光谱仪 美国Nicolet公司;DSHZ-300A水浴恒温振荡器 太仓市强乐实验设备有限公司;DC-0506恒温水浴系统(中国南京) 南京凡帝朗信息科技有限公司;20 kHz超声探头系统;玻璃柱 I.D.×L:30×150 mm,南京寿德实验器材有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓渣中花色苷的提取 参照Cui等[15]的方法并稍作修改。蓝莓渣在25 ℃避光解冻24 h,称取30 g蓝莓渣,按料液比1∶10 g/mL浸渍于体积分数为50%的乙醇水溶液中,用1 mol/L盐酸调节pH至2.0。30 ℃、120 r/min磁力搅拌浸提12 h后,4390 g离心10 min,收集上清液。其后,40 ℃下真空浓缩花色苷粗提液至原体积的1/2,充分除去乙醇后将蓝莓渣花色苷提取液置于-18 ℃下贮藏备用。

1.2.2 吸附剂的预处理 大孔树脂:参照Timothy等[16]的方法对大孔树脂进行预处理。将树脂填充在玻璃柱(I.D.×L:30×150 mm)中,先用200 mL的体积分数95%乙醇水溶液洗涤,再用200 mL去离子水洗脱,之后采用200 mL 4%的盐酸洗脱。然后利用去离子水清洗树脂,直到其为中性,再采用200 mL体积分数5%的NaOH溶液对树脂进行漂洗。最后,用去离子水冲洗树脂,直到洗脱液的pH达到7.0。将上述树脂在60 ℃下进行真空干燥,直至达到恒重。

活性炭膨润土:60 ℃下进行真空干燥至达到恒重;酿酒酵母:于40 ℃下进行真空干燥至达到恒重。

1.2.3 水浴振荡与超声波辅助吸附

1.2.3.1 水浴振荡吸附 参照陶莎等[17]的方法并稍作修改。称取500 mg吸附剂于100 mL锥形瓶中,加入50 mL蓝莓渣提取液(花色苷浓度为160 mg/L、pH2.0),在30 ℃、100 r/min条件下分别采用大孔树脂XAD-7HP、酿酒酵母、活性炭、膨润土进行吸附,吸附时间分别是240、150、180、30 min。在第10、20、30、45、60、90、120、150、180、210、240 min吸取样液500 μL(膨润土因前30 min吸附已经达到平衡,故本文只选择前30 min的图像),以6740×g离心5 min,收集上清液并测定其中总花色苷含量以计算吸附量,以时间为横轴,相应时刻的花色苷吸附量为纵轴,绘制吸附动力学曲线。

1.2.3.2 超声波辅助吸附 称取500 mg吸附剂(大孔树脂XAD-7HP、酿酒酵母、活性炭、膨润土)于100 mL锥形瓶中,加入50 mL蓝莓渣提取液(花色苷浓度为160 mg/L、pH2.0),在30 ℃和超声强度106 W/L条件下吸附,后续处理同水浴振荡吸附(膨润土因前30 min吸附已经达到平衡,故本文只选择前30 min的图像)。

1.2.4 动力吸附模型 采用Lagergren一级动力学方程(式(1))与二级动力学方程(式(2))[18]拟合吸附动力学过程:

qt=qe(1-e-k1t)

1.对联并非高不可攀，更非古人专利，小孩子也能创作对联，关键是师生是否愿意去做，肯否花时间去琢磨。写对联花费时间不多，在校期间老师也可以抽出点时间，引导学生去尝试练笔。

式(1)

式(2)

式中:qt为t时刻的花色苷吸附量(mg/g);qe为花色苷的平衡吸附量(mg/g);t为吸附时间(min);k1为一级动力学速率常数(min-1);k2为二级动力学速率常数(g/(mg·min))。

1.2.5 分析与测定方法

1.2.5.1 花色苷含量和吸附量的测定 参照Vialeta等[19]的方法用分光光度计测定总花色苷含量。将乙醇、水和盐酸按体积比69∶30∶1混匀制成稀释液,对样品进行适当倍数稀释后在540 nm波长处测定吸光值(A540)。总花色苷含量以蓝莓渣提取液中含有的锦葵色素-3-葡萄糖苷当量计,按公式(3)计算:

总花色苷质量浓度(mg/L)=A540×16.7×d

式(3)

式中:16.7为摩尔消光系数;d表示样品的稀释倍数。

花色苷吸附量计算参考袁亚宏等[20]的方法,见公式(4):

式(4)

式中:qt为t时刻吸附剂对花色苷的吸附量(mg/g);c0为蓝莓渣花色苷提取液的初始质量浓度(mg/L);ct为提取液t时刻的质量浓度(mg/L);V为溶液总体积(mL);m为吸附剂质量(mg)。

1.2.5.2 吸附前后吸附剂红外光谱变化 将花色苷提取液、未吸附蓝莓渣花色苷的吸附剂和在超声条件下吸附花色苷至平衡的吸附剂于-47 ℃冷冻干燥72 h,以完全除去样品中水分。将1 mg待测样与100 mg KBr混合,充分研磨,用压片机压成透明薄片。在红外区域下从4000至400 cm-1扫描样品,分析花色苷粗提物中官能团和吸附前后吸附剂表面化学官能团的变化。

1.3 数据处理

实验均重复3次,结果以“平均值±标准差”的形式表示,采用Origin 2017软件对数据进行拟合,采用SAS 8.0的LSD进行显著性分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果分析

2.1 水浴振荡与超声波辅助吸附蓝莓渣花色苷的吸附动力学曲线

图1a显示,随着吸附时间延长,大孔树脂的花色苷吸附量逐渐增加,前60 min吸附速率较快,之后逐渐降低,90 min之后,超声波辅助下大孔树脂的花色苷吸附量显著高于水浴振荡(P<0.05)。在240 min,水浴振荡条件下的吸附量为13.45 mg/g,超声波辅助大孔树脂XAD-7HP对花色苷的吸附量提高了8.62%,为14.61 mg/g。Wang等[12]比较了不同强度超声波(0～400 W)对树脂XAD-16吸附苹果皮多酚过程的影响,发现超声波成功提高了树脂XAD-16吸附苹果皮多酚的吸附量,指出超声波空穴效应引起的传质加速可能是提高吸附剂吸附量的主要原因,本实验同样发现超声波可以提高大孔树脂XAD-7HP对蓝莓渣花色苷的吸附量,因此该原因可能也是本研究中超声波提高花色苷吸附量的原因之一。

图1 水浴振荡和超声波辅助不同吸附剂吸附蓝莓渣花色苷的吸附动力学曲线Fig.1 Adsorption kinetic curves of anthocyanins by different adsorbentsunder the condition of water-bath oscillation and with the help of an ultrasound注:a：大孔树脂吸附;b:酿酒酵母吸附;c:活性炭吸附;d:膨润土吸附。

由图1b可知,超声波辅助作用下,吸附前10 min酵母完成了吸附总量的72.85%,随后吸附速率逐渐降低。超声波辅助下酿酒酵母的花色苷吸附量显著高于水浴振荡(P<0.05)。150 min时,相比于水浴振荡条件下的吸附量4.96 mg/g,超声波辅助酿酒酵母的吸附量提高了19.56%,为5.93 mg/g。Tao等[14]用超声波提高了废弃酵母对果渣中酚类的吸附效率,这与本研究中超声波处理增加了酿酒酵母对蓝莓渣花色苷的吸附量一致,其机理可能是空穴效应促进了酚类化合物在酵母颗粒周围的运动,增强了二者的结合能力,有利于多酚渗透进入酵母细胞的细胞壁和细胞膜,从而改善吸附过程。

图1c显示,吸附前10 min,在超声波辅助和水浴振荡的条件下,活性炭分别完成了吸附总量的77.79%和68.38%,随后吸附速率逐渐降低。同时,超声波辅助下活性炭对花色苷的吸附量显著高于水浴振荡(P<0.05)。在180 min,相比于水浴振荡,超声波作用下活性炭的吸附量提高11.90%,为13.73 mg/g。

由图1d可知,膨润土对花色苷的吸附在10 min时达到吸附平衡,达到平衡的时间显著低于以上三种吸附剂吸附的平衡时间,这可能与膨润土和蓝莓渣花色苷自身的结构特性和二者的相互作用有关。超声波辅助下膨润土对花色苷吸附量显著高于水浴振荡的吸附量(P<0.05)。达到吸附平衡时,相比于水浴振荡下的平衡吸附量9.95 mg/g,超声波辅助下膨润土的花色苷吸附量提高了16.48%,为11.59 mg/g。

四种吸附剂中大孔树脂XAD-7HP对蓝莓渣花色苷的吸附量最大,活性炭次之,其次是膨润土,酿酒酵母的吸附量最小;四种吸附剂中,酿酒酵母在超声波作用下吸附量提高程度最大,这可能是因为酵母结构较为疏松,超声波产生的空穴效应对其影响较大,使得酵母表面更多的活性位点暴露出来,有利于与花色苷结合,从而促进吸附。

2.2 水浴振荡与超声波辅助吸附蓝莓渣花色苷吸附动力学分析

对水浴振荡和超声波辅助下四种吸附材料对花色苷的吸附动力学数据进行拟合,结果如表1所示。结果显示,在水浴振荡和超声辅助下,对于四种吸附剂吸附蓝莓渣花色苷的过程,二级动力学方程拟合结果的决定系数R2均大于一级动力学方程的决定系数R2,这说明Lagergren二级动力学模型能更好地模拟该吸附过程。Chang等[21]、Ana等[22]在研究大孔树脂XAD-7HP和废弃酵母对不同植物来源花色苷吸附性能的过程中,同样发现二级动力学模型能更好地拟合吸附剂吸附蔷薇花萼与葡萄渣提取物中花色苷的过程。

表1 一级动力学模型和二级动力学模型基本参数Table 1 Kinetic parameters of pseudo-first order and pseudo-second order models

2.3 吸附前后四种吸附剂的FTIR光谱表征分析

对花色苷粗提物和吸附花色苷前、吸附后的吸附剂进行红外光谱测定,采用Origin 2017软件进行分析,结果如图2所示。

图2 不同吸附剂傅里叶变换红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of different adsorbents注:a:大孔树脂吸附;b:酿酒酵母吸附;c:活性炭吸附;d:膨润土吸附。A:吸附前;B:吸附后;C:花色苷粗提物。

在花色苷粗提物的红外光谱中,1637 cm-1处是花色苷芳香族C=C键的伸缩振动,1078 cm-1处是蓝莓渣提取物中糖和酸的C-O伸缩振动[23-24]。

图2a为吸附前后大孔树脂的红外光谱结果图。吸附前,大孔树脂主要存在以下特征吸收峰:1733(C=O的弹性振动)、1473和1392(C-H的弯曲振动)、3566和2979 cm-1(O-H和C-H的伸缩振动)[24-26]。吸附后,1637 cm-1处峰强增强,主要是由于花色苷在该波段也存在特征吸收峰,两者叠加使特征峰更加明显,也证明了花色苷被成功吸附。2979 cm-1处的吸收峰移动到2973 cm-1处,可能是基于C-H的伸缩振动,1473和1392 cm-1处的吸收峰分别移动到1471和1390 cm-1处,可能是由于C-H的弯曲振动。3566 cm-1处的吸收峰移动到3446 cm-1处,这说明大孔树脂表面的酚羟基在吸附过程中发生位移,可能用于形成氢键。

图2b为吸附前后酿酒酵母的红外光谱结果图。吸附前,酿酒酵母主要存在以下吸收峰:3399(多糖中-NH2和-OH的伸缩振动)、2925(-CH2的对称和反对称收缩振动)、1653(蛋白质肽键中酰胺基团Ⅰ带-C=O-和-NH-的伸缩振动)、1540(酰胺基团Ⅱ带-C=O-NH-的弯曲振动)、1455(-CH2和-CH3重叠反对称弯曲振动)、1417(-COOH和-OH的弯曲振动)、1243 cm-1(-OH)[27-28]。酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带是蛋白质的特征谱带,这说明蛋白质是酵母细胞的重要成分之一[28]。吸附后,1655和1047 cm-1处吸收峰峰强增加,这可能作为花色苷成功吸附到酵母上的证据。3399 cm-1处吸收峰移动到3378 cm-1,1653 cm-1处吸收峰移动到1655 cm-1,1540 cm-1处吸收峰移动到1533 cm-1,这表明酵母中的多糖和酰胺基团参与了吸附过程,可能是N原子在官能团中提供单双电子,导致基团极性改变[27]。1455 cm-1处吸收峰移动到1456 cm-1,表明吸附过程受氢键和范德华力影响[27];1417 cm-1处吸收峰移动到1373 cm-1,1243 cm-1处吸收峰移动到1241 cm-1,表明-COOH和-OH参与了吸附过程,可能发生了氢键的位移。

图2c为吸附前后活性炭的红外光谱结果图。吸附前,活性炭主要存在以下吸收峰和官能团:1578(芳香族C=C)、1184 cm-1(C-O)[29]。吸附后,1699 cm-1处出现一个新的吸收峰,可能是花色苷中官能团与活性炭表面基团相互作用形成的,这可能表明花色苷被成功吸附。1578 cm-1处吸收峰移动到1589 cm-1,1184 cm-1处吸收峰移动到1199 cm-1,表明活性炭吸附花色苷过程受C=C和C-O影响;在1436 cm-1处有新的吸收峰出现,可能是O-H变形振动或者-CH2变形振动,1519 cm-1处的新吸收峰可能是C=C骨架伸缩振动,这表明花色苷与活性炭表面基团结合,促进了新的官能团的形成。于富玲[29]在研究活性炭对染料的吸附中表明,染料分子与活性炭上的活性位点进行表面配位反应,使活性炭的红外光谱发生变化;此外,活性炭与染料之间还通过范德华力、氢键、专属吸附和电性作用等产生发生吸附,改变官能团的存在形式,影响到相应的红外谱图。

图2d为吸附前后膨润土的红外光谱结果图。吸附前,膨润土主要存在以下吸收峰和官能团:796(石英掺杂物)、694(Si-O的变形和弯曲振动)、523和467(Al-O-Si 和Si-O-Si 的弯曲振动)、918(Al-Al-OH)、1039(Si-O的弯曲振动)、3629(游离-OH的伸缩振动)、3448 cm-1(通过氢键缔合的-OH)[30]。吸附后,1637 cm-1处峰强增强,表明花色苷被成功吸附。1039 cm-1处吸收峰移动到1043 cm-1,694 cm-1处吸收峰移动到692 cm-1,这可能是基于Si-O的变形和弯曲振动;原-OH吸收峰发生移动,分别移至3620和3421 cm-1,李家政等[31]指出能形成氢键的基团如羰基、羟基、酯基等在形成氢键时,其红外吸收的波数将会发生变化,即红移或蓝移,这表明以上基团在吸附过程通过形成氢键而发挥吸附作用,故膨润土能成功吸附花色苷的原因可能是氢键发生了位移。

比较吸附前后四种吸附剂的红外光谱变化,可以发现氢键参与了这四种吸附剂吸附花色苷的过程。其中,酿酒酵母在吸附前后结构变化最大,这可能表明超声作用能较大程度影响酿酒酵母的结构,从而改善其吸附性能,该结果与动力学研究结果一致。

3 结论

四种吸附剂(大孔树脂XAD-7HP、酿酒酵母、活性炭、膨润土)在超声波辅助下花色苷吸附量均显著高于水浴振荡下吸附量(P<0.05),这表明超声波对这四种吸附剂吸附蓝莓渣花色苷均有促进作用。吸附量大小为大孔树脂>活性炭>膨润土>酿酒酵母,其中超声作用对酿酒酵母的吸附能力提高程度最大,提高了19.56%。在30 ℃ 106 W/L超声波辅助和100 r/min水浴振荡条件下的吸附动力学行为表明,二级动力学模型能更好地拟合四种吸附材料对蓝莓渣花色苷的吸附过程。红外分析得知大孔树脂表面的酚羟基可能用于形成氢键,在吸附过程中发挥重要作用;酿酒酵母细胞中的多糖和酰胺基团参与了吸附过程,氢键和范德华力也参与其中;活性炭在吸附后出现了一些新的官能团(O-H、-CH2、C=C),这可能与花色苷与活性炭表面基团相互作用有关;氢键也参与了膨润土对花色苷的吸附过程,故氢键在这四种吸附剂对蓝莓渣花色苷的吸附过程中均发挥着作用。综上所述,在超声波辅助四种吸附剂吸附蓝莓渣花色苷的过程中,树脂有着最大吸附量,超声波对酿酒酵母吸附量的提高程度最大;从吸附效率角度考虑,大孔树脂是较适宜的吸附剂。