GC-FID法同时测定腌制鱼干中9种N-亚硝胺类化合物

夏日耀,梁 棋,杜莲朵,张建军,罗秋水,2,杜 娟,2,熊建华,2,*

(1.江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045; 2.南昌市农产品加工与质量控制重点实验室,江西南昌 330045)

腌制鱼是我国传统的风味加工食品,在其加工和贮藏过程中,由于亚硝酸盐和胺类的相互作用,会产生一类化学物质——N-亚硝胺[1]。其在人体内长期积累会诱发消化系统癌变[2-3]。根据国际癌症研究机构对致癌物质的分类,NDMA和NDEA属于2A 类致癌物,N-亚硝基甲乙胺(N-Nitroso-methylethylamine,NMEA)、N-亚硝基二丙胺(N-Nitrosodi-n-propylanime,NDPA)、N-亚硝基二丁胺(N-Nitrosodibutylamine,NDBA)、NPIP、N-亚硝基吗啉(N-Nitrosomorpholine,NMOR)和NPYR属于2B类致癌物,N-亚硝基二苯胺(N-Nitrosodiphenylamine,NDPhA)属于3类致癌物[4]。这9种物质是食品中常见的挥发性N-亚硝胺[5],因此,对于它们的检测研究一直是食品安全检测领域的热点。目前,我国对食品中存在N-亚硝基二甲胺(NDMA)有限量规定,即肉制品<3 μg/kg和水产制品<4 μg/kg[6]。

目前,肉制品中N-亚硝胺的检测主要通过色谱结合特异性检测器或者色谱串联质谱进行,常见的检测方法有气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)[7]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[8],气相色谱-氢火焰检测器法(GC-FID)[9]、气相色谱-氮磷检测器法(GC-NPD)[10]和液相色谱-串联质谱检测法(LC-MS)[11-13]。其中,GC-FID和GC-NPD是实验室常见仪器,但检测结果受样品杂质干扰较大,使其用于N-亚硝胺类化合物的检测时出现灵敏度较低、检出限较高的缺陷[14]。GC-TEA法仪器专用性强,且价格昂贵[15]。GC-MS法和LC-MS法选择性好,且灵敏度高[16-17],但一般的实验室难以配备。在样品提取方法上,肉制品中常见的N-亚硝胺类化合物提取方法主要有水蒸气蒸馏法[18]和有机试剂超声提取法[19]。水蒸气蒸馏法的样品基质效应小,但提取时间较长,易造成部分成分挥发且操作繁琐。有机试剂提取法操作简单快捷,提取试剂需求量小,但提取液中N-亚硝胺类化合物浓度低,只适用于高灵敏度的检测仪器。因此越来越多的研究开始着重于对样品处理方法的改进。本文采用二氯甲烷作为提取腌制鱼干中N-亚硝胺的溶剂,优化提取、除杂工艺,经C18SPE小柱的富集,使较低剂量的N-亚硝胺类化合物能够在气相色谱-氢火焰检测器上检出,满足一般实验室对于腌制食品N-亚硝胺类化合物安全性的检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腌制鱼干 市售,粉碎过40目筛;N-亚硝胺混合标准品(2000 mg/L,1 mL):N-亚硝基二甲胺(NDMA)、N-亚硝基甲乙胺(NMEA)、N-亚硝基二乙胺(NDEA)、N-亚硝基二丙胺(NDPA)、N-亚硝基二丁胺(NDBA)、N-亚硝基哌啶(NDIP)、N-亚硝基吡咯烷(NPYR)、N-亚硝基吗啉(NMOR)、N-亚硝基二苯胺(NDPhA) (纯度>99%),美国O2si公司;C18SPE小柱 美国Waters公司;Ba(OH)2·8H2O 上海麦克林生物科技公司;二氯甲烷 色谱纯,山东西亚化学工业有限公司;椰壳活性炭 河南祥源水处理材料有限公司;β-环状糊精 上海阿拉丁生化科技有限公司。

Agilent GC-7890B气相色谱仪(FID检测器)、SPE固相萃取装置 美国AgilentTechnologies公司;HC-2518R高速冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;电热恒温烘箱 德国Binder公司;RE-3000旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;WH-12水浴氮气吹干仪 浙江余姚振兴流量仪表厂;JZM-JR351绞肉机 广东飞旺电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

1.2.1.1 GC条件 色谱柱:DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:初始温度40 ℃保持4 min;以4 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,再以20 ℃/min升至200 ℃,保持13.5 min;进样口温度:250 ℃;载气(N2)流速:5.462 mL/min;隔垫吹扫流量:3 mL/min;进样分流比:1∶1;进样量:5.0 μL。

1.2.1.2 检测器条件 FID检测器温度:250 ℃;空气流量:400 mL/min;燃气(H2)流量:40 mL/min;尾吹气(N2)流量:30 mL/min;恒定尾吹。

1.2.2 对照品溶液的制备 将N-亚硝胺混合标准品(2000 mg/L,1 mL)用二氯甲烷稀释定容至1000 mL容量瓶中,得到N-亚硝胺混合标准储备液(2.0 mg/mL),-20 ℃棕色瓶中保存。准确移取混合标准储备液,用二氯甲烷逐级稀释配制成浓度范围为0.05～5 μg/mL的系列标准溶液。按1.2.1色谱条件进样分析,绘制标准曲线,以信噪比为3和10时的标准溶液浓度为定量限和检出限。

1.2.3 供试品溶液的制备

1.2.3.1 试品中N-亚硝胺的提取 称取适量腌制鱼干粉,分别用水蒸气蒸馏法、有机试剂超声提取法、碱液处理结合二氯甲烷萃取法对样品进行提取,比较提取方法。

水蒸气蒸馏法:搭好水蒸气蒸馏装置。称取200 g样品,加入100 mL水和50 g氯化钠于蒸馏瓶中,混匀并检查气密性。取100 mL二氯甲烷及少量冰块至于500 mL锥形瓶中。将冷凝管出口伸入二氯甲烷液面下,锥形瓶冰浴。开启蒸馏装置加热,收集400 mL冷凝液后停止蒸馏。

有机试剂超声提取法:称取200 g样品置于500 mL离心瓶中,加入200 mL二氯甲烷,拧紧瓶盖后涡旋混匀1 min,将离心瓶至于超声波提取器中超声30 min,离心分出上清液,再加入150 mL二氯甲烷重复提取2次。合并上清液。

碱液处理萃取法:称取200 g样品置于500 mL离心瓶中,加入30 g Ba(OH)2·8H2O、200 mL超纯水,拧紧瓶盖后涡旋混匀1 min。置于90 ℃恒温烘箱处理1.5 h。取出离心瓶,静置冷却10 min后,以10000 r/min离心10 min,取上清液,加入40 mL二氯甲烷,涡旋混匀1 min后离心,将上层水溶液分离出后加入30 mL二氯甲烷重复萃取离心2次,合并所有二氯甲烷提取液。

1.2.3.2 样品净化 在二氯甲烷提取液中加入除杂材料,混匀静置后5000 r/min离心5 min将材料分离,除杂材料中再加10 mL二氯甲烷淋洗10 min,收集合并所有二氯甲烷。以无水硫酸钠做脱水过滤处理,滤液30 ℃真空浓缩至5 mL。使用C18SPE小柱进行富集,定容至1 mL,过0.22 μm有机滤膜,待测。

1.2.4 回收率与精密度 选择湖南腊鱼、安徽农家风干鱼、湖北风味鱼干三种样品进行三水平添加实验,计算样品的加标回收率和相对标准偏差。

1.2.5 实际样品检测 采用本实验方法对市场上销售的50种腌制鱼干进行分析检测,每种样品做3次平行实验。

1.3 数据处理

采用Agilent GC-7890B气相色谱仪脱机系统和SPSS 17.0对数据进行处理分析,色谱峰图用Origin 2017绘制。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 色谱柱的优化 选择了3种不同的气相色谱柱:非极性柱HP-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、中等极性柱DB-624(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、强极性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm)对N-亚硝胺混合标准溶液进行分离实验,色谱图如图1～图3所示。结果表明,非极性柱HP-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm)分离出的N-亚硝胺类化合物峰形不对称,有明显的拖尾现象,且目标物有叠峰现象;中等极性柱DB-624(30 m×0.25 mm,0.25 μm)的N-亚硝胺类化合物峰形仍有拖尾现象,目标物未能完全分离。强极性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm)的目标物色谱峰峰形对称,分离效果好,这可能是因为N-亚硝胺类化合物的分子极性强,且具有强挥发性,强极性柱DB-WAXETR对N-亚硝胺类化合物具有一定的吸附作用,能实现更好的分离[20-21]。故选用强极性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm)作为色谱分离柱。

图1 非极性柱HP-5的标准品色谱图Fig.1 The chart for weak polar columnHP-5 of standard mixed solution

图2 中等极性柱DB-624的标准品色谱图Fig.2 The chart for medium polar columnDB-624 of standard mixed solution

图3 强极性柱DB-WAXETR的标准品色谱图Fig.3 The chart for strong polar columnDB-WAXETR of standard mixed solution

2.1.2 柱温升温速率的优化 9种N-亚硝胺化合物的分子量在74.08到198.22之间,由于与氨基连接的基团差异不同,其极性和沸点跨度较大,为使其在色谱柱上达到更好的分离,需优化柱温的升温速率。设置初始温度为50 ℃,分别选择16、8、4、2 ℃/min为初始升温速率。结果表明,当升温速率为16 ℃/min时,溶剂峰与NDMA未能分离;当升温速率为8 ℃/min时,溶剂峰与NDMA开始分离,但分离效果一般;降低升温速率为4 ℃/min,溶剂峰与NDMA分离效果良好;继续降低升温速率为2 ℃/min,分离效果无明显变化,为提高程序效率,故选择4 ℃/min为初始升温速率。当升温至120 ℃时,相对低沸点的4种N-亚硝胺类化合物已经出峰,此时提高升温速率为20 ℃/min升至200 ℃,并保持13.5 min,9种N-亚硝胺可分别出峰,达到较好的分离。因此,最终升温程序为:初始温度40 ℃保持4 min;以4 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,再以20 ℃/min升至200 ℃,保持13.5 min。

2.1.3 载气分流比的优化 由于氢火焰离子检测器相较于质谱灵敏度较低,因此,检测方法既要保证良好的分离效果,也要提高目标物的相对丰度。调整载气分流比是控制目标物分离效果和相对丰度的主要途径之一,分流比越大,峰的分离度越好,但相对丰度越小[22]。实验对比了分流比为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和不分流7种分流方式对目标物出峰效果的影响。结果表明,当分流比为不分流时,NDBA、NDIP、NPYR出现叠峰的现象;当分流比为1∶1时,9种N-亚硝胺分离度和相对丰度均良好;继续增大分流比后,9种N-亚硝胺虽都能实现有效的分离,但相对丰度逐渐变小;因此选择1∶1为载气分流比。

9种N-亚硝胺混合标准溶液经过优化后的方法得到如图4色谱图,表1为进一步采用GC-MS对9种N-亚硝胺混合标准样定性。

图4 9种N-亚硝胺混合标准溶液的气相色谱图Fig.4 The chart for gas chromatography ofnine kinds of N-nitrosamines standard mixed solution

表1 9种N-亚硝胺的保留时间和定性定量离子表Table 1 Retention time,qualitative andquantitativeion for nine N-nitrosamines

2.2 样品预处理的选择

2.2.1 提取方法的优化 由于氢火焰检测器灵敏度低,因此本实验的取样量要大于配备质谱等高灵敏度仪器的检测方法。而腌制鱼干的样品基质复杂,不仅自身含有一定量的油脂,产品还会加入一定量的食用油调味,样品提取的干扰因素较多。实验比较了水蒸气蒸馏法、有机试剂超声提取法和碱液处理结合二氯甲烷萃取法对200 g腌制鱼干的提取效果。结果发现,水蒸气蒸馏法所得的提取液杂质较少,但实验操作复杂繁琐,提取耗时长,N-亚硝胺类化合物受热时间较长损失较大;有机试剂超声提取法操作简单快捷,但提取使用的有机溶剂消耗量较大,且提取液中的油脂较多,给下一步的净化处理增加难度;碱液处理萃取法则通过碱液加热处理,将N-亚硝胺类化合物提取至水溶液的同时,皂化样品中的大部分油脂,之后将水溶液中的N-亚硝胺类化合物萃取至有机溶剂当中[23-25],提取液中干扰物相对较少,并且此方法相对水蒸气蒸馏法耗时较短,消耗的有机溶剂量相对超声提取法少,因此选择碱液处理萃取法作为样品的提取方法。

2.2.2 除杂材料的筛选 由于取样量较大,碱液处理萃取法获得的提取液依然含有一定量的油脂和其他干扰物质,不能直接进行固相小柱富集。研究表明,椰壳活性炭能有效吸附油脂,虽对水中的N-亚硝胺类化合物也有一定的吸附作用[26],但这部分N-亚硝胺可以利用二氯甲烷洗脱,能较好地除去油脂。β-环状糊精能将油脂吸附在其疏水穴内形成球状复合物[27],再经过滤分离,是去除油脂的有效材料。

本实验于100 mL二氯甲烷提取液中加入1 mL混合标准溶液(4 μg/mL),并使用10、15、20 g三个浓度添加量的椰壳活性炭、β-环状糊精进行除杂处理,再经C18SPE小柱富集,浓缩至1 mL测定,计算加标回收率。如表2所示,两种材料对提取液均有一定的除杂效果,但椰壳活性炭处理后的9种N-亚硝胺类化合物的加标回收率总体要高于β-环状糊精,选择椰壳活性炭作为除杂材料。10和15 g椰壳活性炭处理后的9种N-亚硝胺类化合物平均回收率分别为85.57%和85.49%,二者相差不大,而20 g椰壳活性炭处理后的9种N-亚硝胺类化合物的回收率较低。10 g椰壳活性炭处理后的提取液混浊,杂质仍然较多,除杂效果低于15 g椰壳活性炭。因此,选择15 g椰壳活性炭作为除杂材料浓度添加量。

表2 两种材料处理后的9种N-亚硝胺的回收率Table 2 The recoveries of nineN-nitrosamines in treated two materials

2.3 线性关系、检出限、定量限

根据实测样品的取样量,用混合标准储备液配制浓度范围为0.05～5 μg/mL的系列标准溶液进样分析,绘制标准曲线,以信噪比为3和10时的标准溶液浓度为定量限和检出限。结果如表3所示,标准曲线的R2均>0.999。9种N-亚硝胺的检出限和定量限范围分别为0.05～0.29和0.18～0.95 μg/mL。王瑞等[28]使用水蒸气蒸馏法结合GC-FID检测器检测熟肉中的NDEA,其检测限为0.8 μg/mL。本研究的NDEA的检测限(0.12 μg/mL)远低于其结果,说明本检测方法有一定的优越性。

表3 9种N-亚硝胺类化合物的线性关系、检出限、定量限Table 3 Linear relationship,limits of detection and limits of quantification for nine N-nitrosamines

以实测样品的取样量换算,本试验方法的NDMA的检出限为1.45 μg/kg,根据GB 2762-2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》,干制水产制品中NDMA 的限量规定为4 μg/kg,该方法的检出限能满足腌制水产制品中N-亚硝胺类化合物检测的需要。

2.4 回收率和精密度

选择湖南腊鱼、安徽农家风干鱼、湖北风味鱼干三种样品进行添加实验,分别以5、10、15 μg/kg N-亚硝胺混合标准品为添加水平,计算样品的加标回收率和相对标准偏差,结果见表4。9种N-亚硝胺的回收率和相对标准偏差范围为76.8%～129.5%和2.29%～15.5%。根据GBT 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测 附录F》中所规定的食品中禁用物质的范围要求,当被测组分含量小于100 μg/kg时,回收率需>60%[29],说明该方法回收率符合国家标准。

表4 样品中9种N-亚硝胺的回收率及精密度(n=6)Table 4 The recoveries and precision of nine N-nitrosamines(n=6)in samples

2.5 样品检测

采用本实验方法对市场上销售的50种腌制鱼干进行分析检测,每种样品做3次平行实验,结果见表5。腌制鱼干NDEA、NDIP、NPYR的检出率相对较高,分别达到20%、20%、24%。其中NDEA和NPYR含量最高达20.54 μg/kg和15.85 μg/kg,NDIP的最高含量相对较低为4.32 μg/kg。NDBA、NDMA和NMEA检出率分别为14%、10%、8%。最高含量分别为7.54、5.12、3.42 μg/kg。NDPA和NDPhA的检出率较低,含量均在检测限以下,NMOR未检出。说明腌制鱼干中NDEA、NDIP、NPYR普遍存在。目前国标只对水产动物性制品中NDMA有具体的限量4 μg/kg,50种腌制鱼干只有一种超过标准。其中黄花鱼干的色谱图见图5。

表5 50种腌制鱼干中的9种N-亚硝胺检测结果Table 5 Detection results of nineN-nitrosamines in pickling fish

图5 黄花鱼干的色谱图Fig.5 Chromatogram of dried yellow croaker

3 结论

本研究优选了样品提取方法、除杂材料,比较了不同极性的色谱柱对9种N-亚硝胺类化合物的分离效果,优化了检测条件,建立了气相色谱-氢火焰检测器同时测定腌制鱼干的9种N-亚硝胺类化合物的方法。该方法相对国标方法操作简单,NDMA检出限低于国标中干制水产制品NDMA 的限量规定,降低了检测腌制鱼干中N-亚硝胺类化合物的仪器需要,能够实现一般实验室对N-亚硝胺化合物的安全性检测。采用本方法对市售的50种腌制鱼干进行了样品检测,NDEA、NDIP、NPYR检出率分别达到20%、20%、24%,NDBA、NDMA和NMEA检出率分别为14%、10%、8%。NDPA和NDPhA的检出率较低,含量均在检测限以下。NMOR未检出。只有一种样品的NDMA超过国标限量规定。