靓果安和大蒜油的联合抑菌作用及抑菌机理
2020-06-19曾瑶英邵晓露成淑君
曾瑶英,邵晓露,成淑君,余 倩
(仲恺农业工程学院轻工食品学院,广东广州 510225)
果蔬植物病害严重影响果实产量与品质,限制农业更好发展。但化学农药对果蔬植物进行防治时,往往造成环境污染,病害虫产生抗性,同时带来农药残留等问题。植物源农药源于植物提取物,具有污染小、毒性小、病虫不易产生抗性、防治效率高等优点,已成为现今研究的热门[1-3]。植物源农药是指按一定的方法从植物中提取出杀菌物质及其次生代谢产物加工而成的中药制剂,含有的抑菌成分复杂,且不同抑菌成分之间会产生协同增效作用[1]。靓果安作为一种新型的植物源农药,是由黄连、金银花、黄芩、黄柏等二十多种中药材提取而制得,里面还有硫、钙和锌等矿物质,具有价格低廉、毒副作用小、易分解和不易产生耐药性等优点。邹秀华等[4]研究表明,靓果安对核桃溃疡病、桃树流胶病以及苹果果实轮纹病都有很好的防治效果并强壮树体。张萍等[5]研究表明,2.6%的单一或混用靓果安可防治40%～63%的香梨腐烂病。但迄今为止,关于靓果安在实验室条件下的抑菌效果以及抑菌机理的研究还未有报道。由于单一生物农药的抗菌性较差,通过复配农药助剂不仅能有效利用现有资源,更能减少投入成本,提高产品性能,增大抑菌谱。农药助剂在病虫害防治过程中发挥着重要作用,每种农药助剂都有特定的功能,如稀释原液,防止粒滴凝聚变大,增加粒子渗透性、润湿性或粘黏性,预防施药不安全等[6]。
大蒜油是由大蒜压榨而得到的一种油状物,研究发现大蒜油具有强抗菌能力,是一种广谱性抗菌物[7]。大蒜油抗菌原理研究十分透彻,大蒜油中的硫醚化合物、大蒜辣素(C6H10OS2)、大蒜新素(C6H10S3)、α-水芹和醛类化合物等成分对大多数细菌具有抑制作用。大蒜油抑菌原理主要是活性成分中含有的硫醚基(S-O-S),在硫醚基(S-O-S)进入细胞后,细胞中的巯基被氧化成二硫键,影响细胞正常的生理代谢,抑制细胞继续分裂进而起到杀菌的作用[8-9]。
本文选取安全低毒的生物农药靓果安复配农药助剂大蒜油作为杀菌剂,通过试验选出最佳复配组合,降低农药使用量;与此同时进行光镜下菌体形态的观察和投射电镜下细胞微结构的观察来探究抑菌剂的抑菌机理。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
靓果安、大蒜油 潍坊奥丰作物病毒防治有限公司;PBS缓冲液 北京雷根生物技术有限公司;草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘液、95%乙醇、复红染液 广东环凯微生物科技有限公司;金黄色葡萄球菌菌种来源ATCC6538、大肠杆菌菌种来源ATCC6538 上海鲁微科技有限公司。
ACQUITY UPLC型液相色谱仪 美国 Waters公司;Triple-TOFTM5600+型质谱仪 美国AB SCIEX公司;生物显微镜 重庆奥特光学仪器有限责任公司;紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;投射电子显微镜 日本电子株式会社。
1.2 实验方法
1.2.1 活化菌种及制备菌悬液 在超净工作台上将2株供试菌种(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基上,37 ℃培养24 h。
利用麦氏比浊法配制麦氏比浊管,分光光度计法测量不同比浊管的吸光度[10-13],制备好的麦氏比浊管,用紫外分光光度计(波长600 nm)测量不同比浊管的吸光度值,得出标准曲线y=0.0812x+0.164(R2=0.9943),比浊管的浊度与OD值、比浊管的浊度与菌悬液的浊度呈线性关系,而菌悬液的浊度与细菌菌落数呈正相关,因此菌悬液的细菌菌落数可利用分光光度计测定菌悬液的吸光值计算得知。
挑取少量细菌菌落于无菌生理盐水中,振荡5 min,利用分光光度计测量其吸光值,通过标准曲线用生理盐水调整其浓度至1.5×108～3.0×108CFU/mL,再稀释菌悬液浓度至106～107CFU/mL。
1.2.2 抑菌圈的测定方法 参考陈度煌[14]的方法,在此方法上进行改良。将适量营养琼脂倒入平板,凝固后,取100 μL菌悬液,用涂布棒涂布均匀后,将牛津杯平稳放置已涂布菌悬液的平皿上,加入200 μL抑菌剂,盖好平皿盖,置于37 ℃培养箱,培养24 h。
1.2.3 最低抑菌浓度的测定 体外培养细菌18～24 h,抑制细菌生长所需药物的最低浓度称为最低抑菌浓度[15](Minimum inhibitory concentration,MIC),是测量抑菌试剂的抑菌作用大小的指标。
1.2.3.1 靓果安抑菌剂MIC的测定 以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为待测菌株,无菌水为空白对照,靓果安用无菌水稀释成浓度为80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0 mg/mL的抑菌液,取1 mL于装有9 mL牛肉膏蛋白胨的锥形瓶中,摇匀后,趁热倒平板,待平板冷却凝固后,吸取浓度106～107CFU/mL的各菌悬液100 μL于牛肉膏蛋白胨平皿中,用涂布棒均匀涂抹,倒置放于37 ℃的培养箱中培养24 h。以培养皿中不长菌时抑菌剂的浓度确定为最低抑菌浓度,即MIC。
1.2.3.2 大蒜油抑菌剂MIC的测定 方法同1.2.3.1,大蒜油对金黄色葡萄球菌MIC测定:大蒜油用无菌水稀释成浓度为6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0 mg/mL;大蒜油对大肠杆菌MIC测定:大蒜油用无菌水稀释成浓度为51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0 mg/mL。
1.2.3.3 复配液部分抑菌浓度指数 部分抑菌浓度(Fractional inhibitory concentration,FIC)指数为抗菌药药效学参数之一,是两种抗菌药的联合药敏指标[16]。本实验旨在判断两种抑菌剂复配使用后是否达到协同作用。
以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为待测菌株,利用棋盘法[17],分别将0.5 mL浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 MIC的靓果安稀释液和0.5 mL浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 MIC的大蒜油稀释液进行复配,得到1 mL复配液,将复配液加入含有9 mL牛肉膏蛋白胨的锥形瓶中,使其最终各组分浓度为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125 MIC,均匀摇动,趁热倒平板,待平板冷却凝固后,吸取浓度106～107CFU/mL的各菌悬液100 μL于牛肉膏蛋白胨平皿中,用涂布棒均匀涂抹,倒置放于37 ℃的培养箱中培养24 h。以无肉眼可见菌落的最低抑菌剂稀释液浓度为复配液对两株供试菌株的最低抑菌浓度(MIC)。
观察实验结果,得到各个抑菌剂复配使用时的MIC,计算出抑菌剂联合的FIC指数,FIC指数的判断标准为:FIC指数≤0.5为协同作用,0.5
FIC指数=MICA(联合)/MICA(单用)+MICB(联合)/MICB(单用)
1.2.4 靓果安与大蒜油以及复配液对菌体生长曲线的影响 取活化到对数期的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌,调节菌悬液到106～107CFU/mL。每株菌悬液分别按照与靓果安MIC、大蒜油MIC以及复配液MIC体积比1∶50的比例加入,每种菌的每种处理测定时间24 h,在600 nm下每隔2 h测定OD值,以靓果安MIC、大蒜油MIC以及复配液MIC 空白调零并记录吸光值[18]。
1.2.5 光学显微镜的观察
1.2.5.1 样品的前处理 挑取少量对数期的细菌菌落于无菌生理盐水中,振荡几分钟,利用分光光度计测量其吸光值,通过标准曲线用生理盐水调整其浓度至1.5×108～3.0×108CFU/mL,用移液枪移取1 mL的菌悬液于99 mL的LB肉汤中,得到1.5×106～3.0×106CFU/mL的菌悬液肉汤。将浓度为MIC的三种抑菌剂(靓果安、大蒜油、复配液)分别添加入制备好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌肉汤菌悬液中,摇匀后在37 ℃培养24 h。
1.2.5.2 光学显微镜观察 菌体革兰氏染色后在光学显微镜下进行观察[16],以未经抑菌剂处理的为空白组,进行对比,观察结构的差异性。
1.2.6 透射电子显微镜的观察
1.2.6.1 样品的前处理 分别在制备好的浓度为106～107CFU/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液中加入浓度为 MIC 的三种抑菌剂(靓果安、大蒜油、复配液),分别摇匀后在37 ℃培养24 h,离心(2500 r/min,15 min,4 ℃)后去上清液,PBS 缓冲液(0.1 mol/L,pH=7.4)漂洗三次,菌体于3%的戊二醛固定液中,低温下固定,备用[19]。
1.2.6.2 透射电子显微镜观察 使用PBS缓冲液(0.1 mol/L,pH=7.4)冲洗3次,每次15 min。再用1%锇酸固定2 h,PBS冲洗3次,经一系列乙醇(体积分数为30%、50%、70%、90%)逐级脱水,然后用现配的90%丙酮和无水丙酮分别洗脱1～3次,每次15 min。环氧丙烷和环氧树脂1∶1混合后作为浸透剂浸透样品1 h后用纯环氧树脂包埋,于 37、45 ℃下分别聚合 24 h,最后入 60 ℃温箱过夜。待样品块凝固后修块,经铀、铅双染后,JEM-1230型投射电镜下观察、拍照,每个样本重复取两个平行进行观察。
1.3 数据处理
全文的图用Origin 8制作,数据采用SPSS 19进行多重比较分析。
2 结果与分析
2.1 最低抑菌浓度的测定
2.1.1 靓果安抑菌剂MIC的测定 由表1可知,对比实验组与空白组,空白组生长菌落总数增多,可知靓果安对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制作用;金黄色葡萄球菌从20 mg/mL开始平板中的菌落总数为0,可知靓果安对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为20 mg/mL;大肠杆菌在40 mg/mL开始平板中的菌落总数为0,可知靓果安对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为40 mg/mL。
表1 靓果安对实验菌株最低抑菌浓度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration of Liangguoan to the test strains
表5 复配液对大肠杆菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of compound solution on Escherichia coli
2.1.2 大蒜油抑菌剂MIC的测定 由表2可知,对比实验组与空白组,空白组生长菌落总数明显较多,可知大蒜油对金黄色葡萄球菌具有抑制作用;从0.4 mg/mL开始平板中的菌落总数为零,可知大蒜油对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)为0.4 mg/mL。
表2 大蒜油对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)Table 2 Minimum inhibitory concentration of garlic oil against Staphylococcus aureus
由表3可知,对比实验组与空白组,空白组生长菌落总数明显增多,可知大蒜油对大肠杆菌具有抑制作用。从51.2 mg/mL开始平板中的菌落总数为零,大蒜油对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC)为51.2 mg/mL。
表3 大蒜油对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)Table 3 Minimum inhibitory concentration of garlic oil on Escherichia coli
实验室环境下靓果安对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果相当,大蒜油对金黄色葡萄球菌的抑制能力较强,对大肠杆菌的抑制效果较差。
2.1.3 复配液部分抑菌浓度指数
2.1.3.1 复配液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 由表4可知,靓果安和大蒜油联合使用后,对金黄色葡萄球菌的抑菌效果增强。靓果安与大蒜油复配之后对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为:MICA(联合)为0.3125 mg/mL,MICB(联合)为0.00625 mg/mL,可得FIC(金黄色葡萄球菌)为0.03125,表现出协同作用。复配时靓果安和大蒜油的质量比为0.3125∶0.00625,,即50∶1,所以本次实验采用靓果安和大蒜油的比例为50∶1作为最佳配比。
表4 复配液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of compound solution on Staphylococcus aureus
2.1.3.2 复配液对大肠杆菌的抑菌效果 由表5可知,靓果安和大蒜油联合使用后,对大肠杆菌的抑菌效果增强。靓果安与大蒜油复配之后对大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为:MICA(联合)为10 mg/mL,MICB(联合)为3.2 mg/mL,计算可得FIC(大肠杆菌)为0.3125,表现出协同作用。复配时靓果安和大蒜油的质量比为10∶3.2,约为3∶1,所以本次实验采用靓果安和大蒜油的比例为3∶1作为最佳配比。
2.2 靓果安与大蒜油以及复配液对菌体生长曲线的影响
图1为靓果安与大蒜油以及复配液对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响。由图1所示,随着时间的增加,实验组与空白组OD值均呈现上升的趋势。在0～8 h中,上升趋势快速,其中金黄色葡萄球菌空白处理组上升幅度最大,结果表明,三种不同配方的抑菌剂对金黄色葡萄球菌生长具有抑制作用。8～18 h中,菌体数量随着时间的增加而增加,产生一定的竞争机制,导致菌体数量上升不幅度减小,故此,菌体OD值上升幅度缓慢的下降,在18～24 h中,菌体数量趋于平稳,在有限的培养条件下,菌体生长竞争越来越激烈,数量就会慢慢趋于稳定。
图1 金黄色葡萄球菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Staphylococcus aureus
复配液处理组比靓果安单独使用的抑菌效果好,大蒜油单独使用比复配抑菌剂的抑菌效果略好一点,药效相差区别不大,靓果安复配大蒜油中的大蒜油的用量却比大蒜油单独使用的量减少了很多,有明显的农药减量化,表明靓果安复配大蒜油这种抑菌剂具有很好的实用价值。
如图2随着时间增加,大肠杆菌菌体数量也在增加。这与金黄色葡萄球菌的生长的趋势相似的,整体都是一开始幅度增加比较大然后幅度变小,到最后趋于平缓,产生这一现象的原因与金黄色葡萄球菌也是相似的。并且大肠杆菌空白组的菌体数量始终都比其他三个处理的菌体数量多,表明这些抑菌剂对大肠杆菌有抑制作用,靓果安复配大蒜油的抑菌能力比单独使用靓果安或者单独使用大蒜油好。
图2 大肠杆菌生长曲线Fig.2 Growth curve of E. coli
2.3 光学显微镜观察
将每组处理的菌体采用革兰氏染色在光学显微镜里进行观察菌体形态。如图3所示,金黄色葡萄球菌空白组中的菌体成串连接并且连接紧密,菌体呈圆形或者椭圆形,实验处理组菌体分散,不成串连接,菌体体积明显小于空白组,且形状发生改变,不是完整的圆形或椭圆形,在菌体周围有细小的残体,其中复配抑菌剂组菌体更为散乱,体积更小。
图3 光学显微镜下金黄色葡萄球菌细胞形态结构(×1000)Fig.3 Cell morphology of Staphylococcus aureusunder light microscopy(×1000)注:a:空白对照;b:靓果安;c:大蒜油;d:复配液;图4同。
如图4所示,大肠杆菌空白组中的菌体呈长杆状,形状完整,实验处理组的菌体明显变短,体积变小,且更为散乱,在菌体周围形成细小的残体。
图4 光学显微镜下大肠杆菌细胞形态结构(×1000)Fig.4 Morphological structure of E. colicells under light microscope(×1000)
2.4 透射电子显微镜的观察
将每组处理好的菌体放置于JEM-1230型TEM下观察、拍照,每个样本重复取两个平行进行观察,见图5。
图5 透射电子显微镜下金黄色葡萄球菌的形态结构Fig.5 Morphological structure of Staphylococcus aureusunder transmission electron microscope注:a:空白对照,×50000;b:靓果安,×20000;c:大蒜油,×20000;d:复配液,×20000;图6同。
如图5a所示,正常的金黄色葡萄球菌细胞膜完整,呈现圆形,形态饱满,细胞之间的间隙清晰,没有出现细胞破裂和内容物外泄现象,细胞正常生长分裂。如图5b所示,靓果安作用下的金黄色葡萄球菌体积较空白组有所变小,小部分细胞的细胞膜发生破裂,内容物流出,总体上形态仍是圆形。如图5c所示,大蒜油作用下的金黄色葡萄球菌菌体形态发生异常,菌体欠饱满,细胞表面出现破损,内容物外泄,部分细胞膜质分离严重。如图5d所示,靓果安和大蒜油复配作用下的金黄色葡萄球菌菌体细胞膜破裂严重,大量细胞原生质外泄,细胞与细胞之间的界限变得模糊,在细胞体周围可见许多残体。由此可见,抑菌强度为:复配液>大蒜油>靓果安,即复配组对金黄色葡萄球菌的破坏作用相比于单用靓果安或大蒜油更强烈,这为靓果安和大蒜油协同抑制金黄色葡萄球菌提供了有益依据。
如图6a所示,正常的大肠杆菌形态完好,细胞壁和细胞膜光滑平整且紧密相连,细胞质均匀,呈现典型的短杆状,菌体饱满。如图6b所示,靓果安作用下的大肠杆菌菌体表面粗糙,内容物外泄,部分菌体质壁分离现象严重,细胞质出现空洞,形态变得狭长或出现断裂,但整体上仍呈现杆状。如图6c所示,大蒜油作用下的大肠杆菌形态严重扭曲变形,菌体细胞大量碎裂,已失去大肠杆菌短杆状的特征。如图6d所示,靓果安和大蒜油复配作用下的大肠杆菌菌体已被严重破坏,无可见的完整细胞壁细胞膜,变成了大量碎片。由此可见,抑菌强度为:复配液>大蒜油>靓果安,即复配组对大肠杆菌的破坏作用相比于单用靓果安或大蒜油更强烈,这为靓果安和大蒜油协同抑制大肠杆菌提供了有益依据。
图6 透射电子显微镜下大肠杆菌的形态结构Fig.6 Morphological structure of Escherichia coliunder transmission electron microscope
3 结论与讨论
靓果安和大蒜油对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)都具有一定的抑制效果。靓果安和大蒜油的复配对金黄色葡萄球菌表现出协同作用,最佳配比为50∶1;靓果安和大蒜油的复配对大肠杆菌表现出相加作用,最佳配比为3∶1。经复配剂处理的金黄色葡萄菌和大肠杆菌的生长曲线均出现变化,表现为生长缓慢。光学显微镜分析表明,靓果安和大蒜油处理后的菌体分散,其中复配抑菌剂的菌体更为散乱,实验组的菌体形状均发生改变,外形缩小,细胞裂解。透射电镜分析表明,实验组的菌体发生严重异变,细胞脱落溶解,其抑菌机理可能在于破坏菌体的细胞壁和细胞膜,致使细胞死亡[20-23]。
