基于代谢组学方法研究银耳多糖对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用

张 艳,王 爽,李永哲,刘 奔,宋 爽

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院,吉林吉林 132022;2.吉林化工学院研究生院,吉林吉林 132022;3.吉林石化电石厂,吉林吉林 132022)

高血脂又称脂质代谢异常,主要是指血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)或血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平过高和/或血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)水平过低,是常见的代谢性疾病[1]。研究发现,高脂饮食引起的脂质代谢异常伴有肝脏脂肪变性(被称为非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease NAFLD))的病变过程,严重的NAFLD很容易发展为非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化等疾病[2-3],因此控制血脂可在一定程度上有效预防NAFLD。现今,他汀类、贝特类等化学药物是治疗高血脂类疾病的常规药物,虽然这些化学药物疗效显著,但副作用明显,易导致如肌痛、横纹肌溶解症和肝功能异常等问题[4]。因此,开发天然的降脂保肝功能性食品的需求日益增加。

银耳(Tremella)属于真菌类银耳科银耳属,是门担子菌门真菌银耳的子实体,作为绿色食品的典型代表,具有较高的营养价值、巨大的经济价值与开发潜力[5]。银耳多糖是银耳中重要的活性物质,现代研究表明,银耳多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降糖及免疫调节等多种作用[6-8],然而银耳多糖对NAFLD的干预作用和机制研究却鲜有报道。

代谢组学是一种快速对生物体内所有低分子量代谢产物进行定性、定量分析,并寻找代谢物与生理变化相对关系的学科,是系统生物学的重要组成部分[9-10]。近年来,代谢组学在食品、营养科学和中医药领域的应用越来越广泛,为以天然产物为基础开发的功能性食品作用机制及其理论研究提供了强有力的现代化研究手段。本文借助于气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术分析NAFLD模型大鼠肝组织小分子代谢物,并通过主成分分析(principal components analysis,PCA)和正交信号校正偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)模式结合代谢组网络数据库,寻找银耳多糖干预NAFLD大鼠肝匀浆的生物标志物及作用的代谢通路,为开发银耳多糖降脂保肝功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Wistar雄性大鼠30只 体质量(200±20) g,动物许可证号:SCXK(吉)2017-0001,购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心,实验过程中遵循《实验动物的护理和使用指南》(吉林化工学院45号文件),符合吉林省动物伦理委员会规定;银耳多糖(纯度>70%) 实验室自制;N,O-双三甲硅基三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、吡啶 上海麦克林公司;乙腈、二十二烷酸、正庚烷 北京化学试剂厂;l,2-丙二醇、吐温-80、胆固醇 沈阳华东制剂厂;丙硫氧嘧啶 上海朝晖药业有限公司;TC试剂盒、TG试剂盒、LDL-c试剂盒、HDL-c试剂盒、谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷丙转氨酶(AST)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒 深圳雷杜生命科学股份有限公司;所有有机溶剂 均为国产色谱纯。

GCMS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪(配有电喷雾离子源(ESI),AOC-20i自动进样器) 日本岛津公司;HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm) 美国Agilent公司;H2050R型低温高速冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司;Chemray240型全自动生化分析仪 深圳雷杜生命科学股份有限公司;FD-1A-50型冷冻干燥机 江苏天翎仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模、分组及给药 将大鼠按体重随机分为空白组、模型组和银耳多糖组,每组10只。空白组正常饲养,自由饮水进食。模型组和银耳多糖组给予脂肪乳灌胃,10 mL/kg,连续20 d,制备大鼠NAFLD模型。参照文献方法[11-12]制备脂肪乳剂:取猪油25 g,放入200 mL烧杯中,加热至100 ℃,加入25 mL吐温-80,制成油相。在100 mL烧杯中加入30 mL蒸馏水和20 mL 1,2-丙二醇加热,制成水相。然后将水相加入油相,充分搅拌混匀,待温度降低后加入胆固醇1.0 g,丙硫氧嘧啶1.0 g,即制成脂肪乳剂。造模成功后,模型组和银耳多糖组继续给予脂肪乳,10 mL/kg,同时,根据前期预实验确定银耳多糖组给予银耳多糖200 mg/kg(相当于60 kg人的日用量2.2 g)灌胃,空白组和模型组给予水灌胃,连续灌胃28 d。

1.2.2 血液生化指标的测定 末次给药后,麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血清,采用全自动生化分析仪对血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c、ALT、AST和ALP进行测定。并计算动脉硬化指数(Arteriosclerosis index,AI),AI=(TC-HDL-c)/HDL-c,LDL-c/HDL-c比值及TC/HDL-c比值。

1.2.3 肝脏组织病理学检测 取部分肝脏,置4%甲醛溶液中固定,苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色法观察肝脏组织病理形态改变。

1.2.4 采用GC-MS方法对大鼠肝匀浆代谢组学数据的测定与分析

1.2.4.1 肝组织预处理 取肝脏0.5 g加2倍重生理盐水研磨制成肝匀浆,放置于4 mL离心管中4 ℃下以10000 r/min离心15 min,移取上清液100 μL于1.5 mL离心管中,加入250 μL乙腈,混悬3 min混合均匀后冰浴超声。冰浴超声10 min后,4 ℃、12000 r/min下离心10 min,吸取上清液200 μL于1.5 mL离心管中于-55 ℃,真空度999 Pa冷冻干燥12 h。冷冻干燥后,加入50 μL衍生化试剂(V(BSTFA)∶V(TMCS)=99∶1)和50 μL吡啶,于80 ℃水浴反应0.5 h,1 h后加含二十二烷(内标,0.10 g/L)的正庚烷150 μL,混匀后于12000 r/min离心15 min,移取上清液到1.5 mL离心管,用于GC-MS分析。

1.2.4.2 GC-MS测试条件 进样口温度:280 ℃;分流比:10∶1;载气:氦气;流速:1.65 mL/min;柱箱温度:60 ℃;柱温程序:起始温度60 ℃保持3 min后,以6 ℃/min升温到290 ℃保持10 min;进样量:0.2 μL,离子源和接口温度分别为200和230 ℃;电子能量:0.85 eV;溶剂延迟:5.5 min;全扫描模式,扫描范围m/z:35～600。

1.2.4.3 代谢组学数据处理及分析 cdf格式的代谢组学原始数据经XCMS Online(https://xcmsonline.scripps.edu/index.php)对得到的数据进行峰提取、峰对齐、峰匹配、峰强度校正和消除噪音等操作,将结果转化为包含化合物保留时间和质荷比信息的csv格式文件,导入SIMCA-P 13.0,通过PCA分析和OPLS-DA分析,进行非靶标代谢组学分析。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 银耳多糖对NAFLD大鼠血脂和肝功能指标的影响

根据《中国成人血脂异常防治指南》,TG≥1.70 mmol/L为高TG血症,TC≥5.18 mmol/L为高TC血症,LDL-c≥3.37 mmol/L为高LDL-c血症,HDL-c≤1.04 mmol/L为低HDL-c血症,符合其中任一项即为血脂异常[13-14]。此外,ALT和AST的含量是血清中提示肝损伤的重要指标[15]。由表1可知,与空白组比较,模型组血清TC、TG、LDL-c、AI、LDL-c/HDL-c及TC/HDL-c水平极显著升高(P<0.01),HDL-c水平显著下降(P<0.05),与此同时,ALT、AST和ALP水平极显著升高(P<0.01),表明大鼠NAFLD模型建立。与模型组比较,银耳多糖组血清TC、AI、LDL-c/HDL-c及TC/HDL-c水平极显著降低(P<0.01),TG和LDL-c水平显著降低(P<0.05),HDL-c水平显著升高(P<0.05),ALT、AST和ALP水平显著降低(P<0.05),表明银耳多糖具有明显的降脂保肝作用,可以改善NAFLD大鼠的血脂异常和肝功能异常。

表1 银耳多糖对NAFLD大鼠血脂和肝功能的影响(n=10)Table 1 Effect of Tremella polysaccharides on plasma lipid and liver function of NAFLD rats(n=10)

2.2 组织病理学检查

病理结果(图1)表明,空白组大鼠的肝组织结构正常,肝小叶结构清晰,肝组织细胞清晰可见,无脂肪组织增生;模型组肝细胞脂肪变性明显,伴有炎性细胞浸润和脂肪结缔组织增生;银耳多糖组的肝组织细胞情况有明显改善,肝组织细胞相对清晰、部分肝细胞表现为弥漫脂肪变性及胞浆疏松化,但大部分肝细胞结构正常。由此可见,银耳多糖可降低大鼠肝脂肪蓄积,减轻肝脏的脂肪变性程度。

图1 银耳多糖对大鼠肝脏组织病理形态的影响(400×)Fig.1 Effect of Tremella polysaccharideson the pathological morphology of rats’ liver(400×)注:A:空白组;B:模型组;C:银耳多糖组。

2.3 代谢组学分析

2.3.1 各组肝匀浆代谢轮廓分析 如总离子流(TIC)图(图2)所示,3组大鼠肝匀浆中代谢物均得到良好的分离,色谱峰保留时间主要集中在6～45 min,且有明显的不同,表现在代谢物的保留时间及峰面积上的差异。为了进一步检测空白组、模型组和银耳多糖组大鼠代谢轮廓的变化情况,对3组大鼠肝匀浆代谢谱的数据进行PCA分析(图3)。由PCA图可以看出空白组、模型组和银耳多糖组能够分开并且呈明显的聚类特征。模型组的样本远离空白组的样本,而银耳多糖组样本更接近于空白组,说明银耳多糖对NAFLD大鼠的异常代谢轮廓有调节作用,更趋近于空白组。

图3 三组大鼠肝匀浆代谢组学的PCA图Fig.3 PCA of metabolomics in three groups of rats’ liver注:▲:空白组;■:模型组;●:银耳多糖组。

图2 空白组、模型组及银耳多糖组的TIC图Fig.2 Total ion chromatography ofcontrol group,model group and TP group注:A:空白组;B:模型组;C:银耳多糖组。

2.3.2 标志物的鉴定 在OPLS-DA(图4A、4C)图中,空白组和模型组可以明显分为两部分,模型组和银耳多糖组也可以明显分为两部分,表明组间差异远远大于组内差异。在S-plot(图4B、4D)中,S型两端的点为潜在的生物标志物,同时以VIP>1.0和P<0.05作为生物标志物的判断标准。通过匹配NIST(http://webbook.nist.gov/chemistry/),METLIN(https://metlin.scripps.edu/),HMDB(http://www. hmdb. ca/)和KEGG(http://www. genome. jp/kegg/)数据库和查阅相关文献,最终确定12个银耳多糖治疗酒精性脂肪肝的内源性代谢物为潜在的生物标志物(表2)。其中,与空白组比较,模型组苹果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、柠檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、顺-乌头酸和乙酰乙酸水平显著升高(P<0.05),甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平降低(P<0.05)。与模型组比较,银耳多糖组苹果酸、延胡索酸、D-葡萄糖、柠檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、顺-乌头酸和乙酰乙酸水平降低(P<0.05),甘氨酸、山梨醇和D-葡萄糖醛酸水平升高(P<0.05)。上述结果表明,银耳多糖对12个生物标志物的异常水平均具有显著的逆转作用,能够使得它们的表达趋于正常水平。

图4 三组大鼠肝匀浆代谢组学的OPLS-DA图和S-plot图Fig.4 OPLS-DA and S-plot of metabolomics in three groups of rats’ liver注:A:空白组与模型组OPLS-DA图(▲为空白组,◆为模型组);B:空白组与模型组S-plot图;C:模型组与银耳多糖组OPLS-DA图(▲为银耳多糖组,◆为模型组);D:模型组与银耳多糖组S-plot图。其中OPLS-DA的横坐标代表每个物质在第一主成分上的载荷大小,纵坐标代表每个物质在第二主成分上的载荷大小;S-plot的横坐标代表每个物质在第一主成分上的载荷大小,纵坐标代表每个物质和第一主成分相关系数(可靠性)的大小。

表2 银耳多糖干预NAFLD大鼠的生物标志物Table 2 Biomarkers of Tremella polysaccharides interfered with NAFLD rats

2.3.3 代谢通路分析 通过MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)的代谢通路分析筛选影响因素大于0.1的代谢通路为主要影响的代谢通路。如图5所示,这12种标志性代谢物主要涉及酮体的合成和代谢,乙醛和二羧酸代谢,抗坏血酸和醛酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,TCA循环和丁酸代谢6种代谢途径。

图5 代谢路径分析Fig.5 Metabolic pathway analysis

NAFLD是可影响多个器官的代谢综合征,肝脏是第一个被积累的器官,最初表现为肝脂肪,继而引起包括线粒体功能障碍的继发效应,如氧化损伤和脂肪细胞因子失衡等[16-17]。肝细胞内脂肪的大量沉积导致的氧化损伤是在NAFLD的病理过程起关键作用[18]。氧化损伤可导致肝脏线粒体功能障碍并直接导致ATP的生成障碍[19]。TCA循环是碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢的重要枢纽,也是能量代谢产生ATP的重要途径[20]。苹果酸、柠檬酸、延胡索酸和顺-乌头酸是TCA循环的主要产物。丙酸是丙酮酸代谢的中间体,通过参与丙酮酸代谢间接影响体内ATP的生成。D-核糖是ATP的结构组成部分,其水平间接反映体内能量代谢产生ATP情况。D-葡萄糖是机体直接利用的能量来源。山梨醇参与乳酸代谢途径也影响能量代谢。如表2所示,与空白组比较,模型组上述生物标志物水平均明显升高,表明模型组大鼠能量代谢异常。此外,苹果酸、柠檬酸和顺-乌头酸也参与乙醛酸和二羧酸代谢。模型组苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、顺-乌头酸、丙酸、D-核糖和D-葡萄糖水平升高,山梨醇水平降低,表明模型组能量代谢异常的同时乙醛酸和二羧酸代谢也出现了异常。经银耳多糖治疗后,这些生物标志物水平有所恢复,表明银耳多糖可以调节能量代谢和乙醛酸和二羧酸代谢异常。

长期高脂肪饮食可增加脂肪含量,从而增加血液中的游离脂肪酸水平,进而导致肝脏游离脂肪酸的大量涌入造成过高的肝脏TG浓度和高TG血症[21-22]。酮体是脂肪酸在肝脏进行正常分解代谢所生成的特殊中间产物,乙酰乙酸是其代谢产物。正常生理情况下,酮体及其代谢产物在体内的含量很低[23]。NAFLD病理状态下,蓄积的脂肪导致脂动员增强,脂肪酸分解,肝脏中酮体及代谢产物的水平也会增加,甚至还会引起酸中毒[24]。乙酰乙酸也参与丁酸代谢。丁酸代谢上的许多物质最终用于生产酮体。此外,辛二酸也是脂肪酸的代谢产物。模型组肝脏乙酰乙酸和辛二酸水平明显升高,表明模型组肝脏脂肪酸分解代谢加强,酮体的合成和代谢明显增加。经银耳多糖治疗后,乙酰乙酸和辛二酸水平有所降低,表明银耳多糖可以通过调节异常的酮体的合成和代谢,抑制脂肪酸分解,减少肝脂肪蓄积,减轻肝脏的脂肪变性程度。

活性氧(reactive oxygen species,ROS)在NAFLD发展和恶化中起关键作用[25]。ROS可以过氧化膜磷脂和蛋白质产生严重的细胞氧化损伤[26-27]。正常生理条件下,机体ROS和抗氧化剂的水平保持动态平衡,然而,NAFLD患者体内则出现ROS水平升高或抗氧化剂水平降低的情况[28]。谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是体内清除ROS的重要物质之一[29]。甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸是合成GSH的原料。甘氨酸是甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢上的重要产物,其水平的降低间接影响GSH的合成和机体的抗氧化能力。D-葡萄糖醛酸是抗坏血酸和醛酸代谢途径上的物质。抗坏血酸和醛酸代谢也是和保肝作用有关的代谢[30]。模型组甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平降低表明NAFLD大鼠抗氧化能量降低。给予银耳多糖后,甘氨酸和D-葡萄糖醛酸水平上调,表明银耳多糖还可以通过调节甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,抗坏血酸和醛酸代谢水平改善机体的氧化损伤,增加抗氧化能力,发挥保肝作用。

3 结论

银耳多糖可降低NAFLD大鼠血清TC、TG、LDL-c、ALT、AST和ALP水平,增加HDL-c水平,并可降低NAFLD大鼠肝脂肪蓄积,减轻肝脏的脂肪变性程度。其作用机制与调节12种生物标志物(苹果酸、山梨醇、甘氨酸、D-葡萄糖醛酸、延胡索酸、D-葡萄糖、柠檬酸、D-核糖、丙酸、辛二酸、顺-乌头酸和乙酰乙酸)所对应的6条主要代谢通路(酮体的合成和代谢,乙醛和二羧酸代谢,抗坏血酸和醛酸代谢,甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢,TCA循环和丁酸代谢),使其向正常状态转变有关,从而缓解NAFLD大鼠代谢紊乱的症状,发挥降脂保肝功效。