不同品种紫花苜蓿对镍的吸收累积特性研究

马晓慧，王 钰，姜 梦，李松栋，谭思洋，张玉芹，柳炳辉

(1. 中国地质科学院岩溶地质研究所，广西 桂林 541000；2. 中国地质大学(北京)，北京 100083；3. 华北科技学院，北京 东燕郊 065201；4. 太原理工大学，山西 太原 030024；5. 贵州大学，贵州 贵阳 550025)

0 引言

随着我国工农业的迅速发展，土壤重金属污染日益严重，使得土壤重金属污染治理备受关注[1]。每年粮食因重金属污染造成的直接经济损失超过200亿元[2，3]。据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示，重金属镍(Ni)的点位超标率为4.8%，在全国点位超标率最高重金属排行中仅次于镉(Cd)[4]。镍是生物体内不可缺少的微量元素，影响着某些酶的活性，对维持细胞的氧化还原状态十分重要，同时参与各种生理、生化和生长反应[5]。但人体长期接触过量的Ni会引起神经衰弱、致畸、致癌、致突变等，同时也会导致植物生物量减少、抑制叶绿素合成，破坏蛋白质合成等。因此，解决土壤重金属Ni污染问题十分迫切，而植物修复是一项最简单、最安全、成本最低的处理方法[6]。

寻找富集能力强、生物量大的植物是植物修复技术的基础和关键[7]。超富集植物是实现植物修复的重要材料。根据目前广泛采用的重金属超富集植物的标准[8-9]，植物叶片或地上部富集Zn、Mn的含量超过10000 mg/kg ，Ni、Pb、Cu、Cr的含量应超过1000 mg/kg，且生物转运系数>1，才能称之为超富集植物。目前已经发现的镍超富集植物约有292种[10]，但我国尚未发现镍超富集植物。相对于超富集植物，海州香薷、紫花苜蓿等富集型植物可以积累中等含量的重金属，尽管其体内的重金属含量低于超富集植物，但这类植物生物量较大，实际吸收提取的重金属总量有时大于超积累植物[11-12]。因此,利用生长快速、拥有高生物量的富集型植物来修复污染土壤，成了近年来国内外研究的一个热点。

紫花苜蓿是豆科苜蓿属植物，有“牧草之王”之称，根部生长的根瘤菌具有很强的固氮能力，不仅能够改善土壤物理性状，还能改善土壤的养分状况。一般利用年限为5～6年，一年可收割2～4次，大大增加了地上部分的生物量，也提高了地上部分富集的重金属量。研究表明，紫花苜蓿对土壤中多种重金属镍、镉、铅、铜都具有一定的富集能力[13-16]。因此，紫花苜蓿是极具有应用前景的土壤重金属污染修复植物。本文将不同品种的紫花苜蓿在含有不同Ni浓度的水溶液中进行水培实验，旨在比较不同品种紫花苜蓿对Ni的吸收、富集和转运特性，以筛选出对Ni吸收、富集能力最强的品种。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试植物：三得利、超人、北极熊、W1319和前景5个品种紫花苜蓿。

Hoagland营养液，配方：硝酸钙 945 mg/L、硝酸钾 607 mg/L、磷酸铵 115 mg/L、硫酸镁 493 mg/L、铁盐溶液 2.5 ml/L、微量元素 5 ml/L、pH值6.0。

1.2 试验方案

(1) 植物材料的培养与采集

以蛭石为基质，将三得利、超人、北极熊、W1319和前景5个紫花苜蓿品种播种于12穴的育苗盘中，在人工气候箱里25℃恒温培养。待3～4天出苗后，加1/4浓度Hoagland营养液，光照/黑暗交替(16/8小时)培养。一周后将育苗盘转移至植物培养架，光暗交替培养20天。培养20天后将其移栽至水培箱，用充气泵通气，1/2浓度Hoagland营养液培养。水培箱长39 cm，宽27 cm，高15 cm，内部放置一长31 cm，宽21 cm，高 7.2 cm的锡纸盒以盛放营养液。先在自然光下缓苗2天，然后光暗交替培养。期间每天测定并调节营养液的pH值，使其稳定在7.0左右，同时适当补充纯净水和营养液保持水位。

水培20天后，在更换的营养液中添加镍对幼苗进行处理，设置5种Ni浓度(0 μg/ml、1 μg/ml、3 μg/ml、6 μg/ml、9 μg/ml)，共25种处理。每4天更换一次营养液，期间每天测定并调节营养液的pH值，使其稳定在7.0左右，同时适当补充纯净水保持水位。处理14天后采集样品。由于水培紫花苜蓿生物量较小，在采样时将三株苗合成一个样品进行处理。

(2) 样品的处理与制备

清理附着在植物上面的杂质，再用去离子水冲洗，植物的根用5 mol/L的Ca(N03)2溶液浸泡30 min以交换去掉其表面吸附的金属离子，取出后用去离子水冲洗2～3次，沥去水分，将每株苗分为茎叶部分和根部分，分别进行收集和处理。先测定鲜重，然后在105℃下杀青30 min，再置70℃的烘箱中烘至恒重(24 h)，烘干后，分别测定各个样品的干重。

将烘干后的植物样品置于玻璃研钵中研碎，编号、称量(因干重大多小于0.20 g，故全部用于制备)，在混酸体系为 HNO3：H2O2为5∶1的条件下置于电热板上消解。首先按比例添加酸系，常温下静置6～8 h后，再置于通风橱中的电热板上。先用80℃加热处理1 h，再用高温120℃处理1～1.5 h。持续处理之后，直到不再产生棕色而变为白色的呈酸性的气体排出为止，使其完全消解无沉淀。然后再设定130℃的温度，驱赶容器里面多余的硝酸，直到容器中溶液剩1～2 ml，然后再转移至带塞比色管中，并用1%硝酸定容。所有实验均设空白对照组。

(3) 样品的测定

采用火焰原子分光光度法，制作标准曲线，测定每个样品中的Ni含量。

1.3 评价指标

(1) 生物量

通过测定样品茎叶部分和根的鲜重和干重，来判断不同品种紫花苜蓿对于镍的耐受性。

(2) 生物富集系数

生物富集系数(Bioconcentration Factor, BCF)为植物体内某种重金属含量与相应环境中重金属含量的比值。生物富集系数是描述重金属在生物体内累积趋势的重要指标。

BCF为植物组织中重金属浓度与溶液(土壤)中重金属浓度的比值

(3) 转运系数

转运系数(Translocation Factor, TF)是指植物地上部分某种重金属含量与根部该种重金属含量的比值。转运系数用来评价植物将重金属从地下部向地上部的运输和富集能力。转运系数大的植物从根系向地上部分转移的吸收量大。

TF为植物茎叶中重金属浓度与植物根部重金属浓度的比值

1.4 数据处理分析

采用SPSS19、Origin2018等软件绘制相关分析图，并进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种紫花苜蓿生物量比较

由表1和表2可知，对茎叶部分来说，在Ni处理浓度为0 μg/ml(对照)时，W1319品种的生物量最小(0.80 g)，与三得利、超人、前景和北极熊品种存在显著性差异，且后四个品种之间无显著性差异；在Ni处理浓度为1 μg/ml时，超人品种和前景品种的生物量与对照相比显著下降，北极熊品种生物量变化很小，而三得利品种和W1319品种的生物量较对照显著升高，升高幅度分别为20.4%和87.5%，说明超人品种和前景品种对低浓度Ni处理比较敏感，北极熊品种有一定耐受性，而低浓度Ni处理对三得利品种和W1319品种的生长有显著促进作用。此时超人品种茎叶部分的生物量最低，与前景品种和W1319品种无显著性差异，与北极熊品种和三得利品种具有显著性差异(P<0.05)。在Ni处理浓度为3 μg/ml时，与对照组相比，除W1319品种外，北极熊、前景、三得利、超人四个品种的生物量均显著下降，下降幅度分别为18.0%、46.2%、49.3%和53.3%，说明除W1319品种耐受性较强外，其余4个品种的生长已经受到较严重的抑制。在Ni处理浓度继续升高到6 μg/ml时，所有品种的生物量继续显著下降，少量植株出现发黄和枯萎症状；当Ni处理浓度升高到9 μg/ml时影响趋于平缓，此时多数植株枯萎。

对根部来说，在Ni处理浓度为0 μg/ml(对照)时，5个品种的生物量相近，相互之间无显著性差异。在Ni处理浓度为1 μg/ml时，超人、W1319和前景3个品种的生物量与对照组相比显著下降，下降幅度分别为56.7%、20.7%和23.5%，而三得利品种和北极熊品种生物量增幅不大，说明超人、W1319和前景3个品种对低浓度Ni处理比较敏感，尤其超人品种最为突出，三得利品种和北极熊品种具有一定耐受性。此时超人品种的根部生物量最低，与三得利品种和北极熊品种有显著性差异。在Ni处理浓度为3 μg/ml时，所有品种的生物量和对照组相比均显著下降，表明植物根部生长受到抑制，此时，三得利品种与北极熊品种的生物量相近，说明两者在该Ni处理浓度下敏感程度差不多，超人、W1319和前景3个品种的生物量几乎一样，说明三者在该Ni处理浓度下敏感程度一致，且三得利品种和北极熊品种均与其它3个品种存在显著性差异。当Ni处理浓度高于6 μg/ml时，影响趋于平缓，进一步抑制根部的生长，且植株出现枯萎现象。

表1 不同品种紫花苜蓿茎叶生物量 g

备注：同一列不同字母表示不同品种间差异显著(P<0.05)。

表2 不同品种紫花苜蓿根部生物量 g

备注：同一列不同字母表示不同品种差异显著(P<0.05)。

如图1所示，随着Ni处理浓度的增加，三得利、W1319和北极熊3个品种的生物量表现为先升高后逐渐减小，说明低浓度Ni促进这三个品种的生长发育，高浓度Ni抑制其生长发育；超人品种和前景品种的生物量表现为持续降低，说明超人品种和前景品种对低浓度的Ni比较敏感，且随着浓度升高其生长发育受到更强的抑制。

图1 不同品种紫花苜蓿整株鲜重生物量图

2.2 不同品种紫花苜蓿中Ni含量比较

表3为不同品种紫花苜蓿茎叶Ni含量。在Ni处理浓度为1 μg/ml时，超人品种对Ni的吸收能力最强，前景品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：超人>W1319>三得利>北极熊>前景，且前景品种和超人、W1319、三得利、北极熊4个品种存在显著性差异，后四个品种相互之间无显著性差异；在Ni处理浓度为3 μg/ml时，北极熊品种对Ni的吸收能力最强，三得利品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：北极熊>前景>W1319>超人>三得利，且它们之间不存在显著性差异；在Ni处理浓度为6 μg/ml时，超人品种对Ni的吸收能力最强，三得利品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力的强弱表现为：超人>W1319>前景>北极熊>三得利，且超人品种分别与三得利品种和北极熊品种存在显著性差异；在Ni处理浓度为9 μg/ml时，W1319品种对Ni的吸收能力最强，三得利品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：W1319>超人>北极熊>前景>三得利，且W1319品种分别与前景品种和三得利品种存在显著性差异。

表3 不同品种紫花苜蓿茎叶部分Ni含量 μg/g

备注：同一列不同小写字母表示不同品种间差异显著(P<0.05)。同一行不同大写字母表示不同浓度间差异显著(P<0.05)。

由表4可知不同品种紫花苜蓿根部Ni含量，在Ni处理浓度为1 μg/ml时，超人品种对Ni的吸收能力最强，三得利品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：超人>W1319>北极熊>前景>三得利，且不同品种之间不存在显著性差异；在Ni处理浓度为3 μg/ml时，W1319品种对Ni的吸收能力最强，超人品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：W1319>北极熊>前景>三得利>超人，且W1319品种分别与前景、超人、三得利3个品种存在显著性差异，北极熊品种分别与超人品种和三得利品种存在显著性差异；在Ni处理浓度为6 μg/ml时，前景品种对Ni的吸收能力最强，北极熊品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：前景>超人>三得利> W1319>北极熊，且北极熊品种分别与前景、超人、W1319和三得利4个品种存在显著性差异，前景品种分别与三得利品种和W1319品种存在显著性差异；在Ni处理浓度为9 μg/ml时，W1319品种对Ni的吸收能力最强，三得利品种对Ni的吸收能力最弱，5个品种对Ni的吸收能力强弱表现为：W1319>超人>北极熊>前景>三得利，且三得利品种、北极熊品种、W1319品种两两之间存在显著性差异，前景品种与W1319品种存在显著性差异，三得利品种与超人品种之间存在显著性差异。

表4 不同品种紫花苜蓿根部Ni含量 μg/g

备注：同一列不同小写字母表示不同品种间差异显著(P<0.05)。同一行不同大写字母表示不同浓度间差异显著(P<0.05)。

由图2(a)和图2(b)可知，在相同的Ni处理浓度下，5种紫花苜蓿的根部Ni含量远远高于茎叶。紫花苜蓿的根部与含Ni的水培液直接接触，在根部从水培液中吸收营养物质和水分时，水培液中的Ni也被根部吸收，并且将吸收的Ni固定在根部，较少部分随着植物内循环流动到茎叶，从而造成根部吸收的Ni含量远远高于茎叶吸收的Ni含量。在所有Ni处理浓度下，植株Ni含量都未达到超富集植物的临界值1000 mg/kg。在Ni处理浓度为6 μg/ml和9 μg/ml时，植株生长已经受到严重抑制且部分出现枯萎。

图2 不同品种紫花苜蓿茎叶和根的Ni含量图

2.3 不同品种紫花苜蓿积累的镍总量

由图3(a)可看出，5个品种紫花苜蓿茎叶部分，在1 μg/ml的Ni处理浓度下，5个品种紫花苜蓿对Ni的积累量的大小表现为：三得利>北极熊>W1319>超人>前景；在3 μg/ml的Ni处理浓度下，5个品种紫花苜蓿对Ni的积累量的大小表现为：北极熊>三得利>前景>超人>W1319；在6 μg/ml的Ni处理浓度下，5个品种紫花苜蓿对Ni的积累量的大小表现为：超人>北极熊>前景>三得利>W1319；在9 μg/ml的Ni处理浓度下，5个品种紫花苜蓿对Ni的积累量的大小表现为：前景>超人>北极熊>W1319>三得利。由以上比较可知，在多个Ni处理浓度下，W1319品种对Ni的积累量均小于其它品种。

通过植物吸收的方式修复土壤重金属污染，主要是通过收割植物地上部分带走其积累的重金属，因此提高植物地上部分累积的重金属量是修复的关键。从图3(b)可以看出，随着 Ni处理浓度的升高，根部吸收的Ni明显地表现出向茎叶部分转运并累积的趋势，5个品种的茎叶部分积累Ni的能力表现出明显差异，这提示我们，如果收集更多的紫花苜蓿品种，有可能从中筛选获得镍富集能力较强的品种，并应用于Ni污染土壤的修复实践。

图3 不同品种紫花苜蓿茎叶和根部的Ni积累总量

2.4 不同品种紫花苜蓿对Ni的富集能力

由图4、表5可知，5个紫花苜蓿品种根部的富集系数均远远大于茎叶的富集系数，这是因为根部Ni含量远高于茎叶Ni含量。同一部位不同紫花苜蓿品种的富集系数也是有差异的。在Ni处理浓度为1 μg/ml时，各品种紫花苜蓿的富集系数最大，随着Ni处理浓度的增加，所有品种的富集系数整体呈下降趋势。这是因为随着Ni处理浓度的升高，植株吸收累积的Ni总量增加至抑制植株生长的程度，此时植株启动防御反应，减少了对Ni的吸收，使得茎叶部分Ni含量未能与Ni处理浓度成比例地增加。

图4 不同品种紫花苜蓿整株对Ni的富集系数

在相同Ni处理浓度下，各品种紫花苜蓿对Ni的富集系数相差不大。在Ni处理浓度为1 μg/ml时，各品种紫花苜蓿富集系数表现为：超人>W1319>北极熊>前景>三得利；在Ni处理浓度为3 μg/ml时，各品种紫花苜蓿富集系数表现为：W1319>北极熊>前景>三得利>超人；在Ni处理浓度为6 μg/ml时，各品种紫花苜蓿富集系数表现为：前景>超人>W1319>三得利>北极熊；在Ni处理浓度为9 μg/ml时，各品种紫花苜蓿富集系数表现为：W1319>超人>北极熊>前景>三得利。

表5 不同品种紫花苜蓿对Ni的富集系数

2.5 不同品种紫花苜蓿对Ni的转运能力

转运系数可用来评价植物将重金属从根部向茎叶不同器官转运的能力[17-18]。各品种紫花苜蓿对Ni的转运系数如表6。在Ni处理浓度为1 μg/ml时，各品种紫花苜蓿转运系数表现为：三得利>超人>北极熊>W1319>前景；在Ni处理浓度为3 μg/ml时，超人品种的转运能力最高，前景品种和三得利品种相差不大，W1319品种转运能力最低；在Ni处理浓度为6 μg/ml时，超人品种转运系数最高，为前景品种的二倍；在Ni处理浓度为9 μg/ml时，三得利品种转运系数最高，其余品种转运系数依次为：超人>北极熊>前景>W1319。

5个紫花苜蓿品种对Ni的转移系数均未超过1，其原因可能是某些植物会促进重金属在根部的吸附和沉积，减少向上转移，通过根际固定作用来稳定污染土壤中的重金属，造成植物的转运能力不同[19]。本研究中5个紫花苜蓿品种茎叶部分的Ni含量在69.58 mg/kg至610.36 mg/kg之间，均未达到1000 mg/kg，转运系数也远小于1。但是由于田间种植的紫花苜蓿生物量很大，且一年能收割2～4茬，其单位面积的植株对Ni的总富集量可能不会低于超富集植物。紫花苜蓿是一种有前景的土壤重金属污染修复植物。

表6 不同品种紫花苜蓿对Ni的转运系数

3 结论

(1) 在相同Ni处理浓度下，不同品种紫花苜蓿的生物量表现各异，超人品种和前景品种对低浓度Ni处理比较敏感，三得利品种和北极熊品种具有一定耐受性；在3 μg/ml Ni处理浓度下，对W1319品种的茎叶部分表现出促进作用，对其余品种均为抑制作用；在Ni处理浓度不低于6 μg/ml时，抑制植株生长发育，影响趋于平缓，且植株出现发黄枯萎的现象。

(2) 在不同Ni处理浓度下，同一品种紫花苜蓿的生物量表现也不同，随着Ni处理浓度的增加，Ni对三得利、W1319和北极熊3个品种的生长发育表现为先促进后抑制，对超人品种和前景品种的生长发育表现为抑制。

(3) 随着Ni处理浓度的升高，茎叶部分的Ni积累量随之增加，北极熊品种的Ni积累量最高。根部吸收的Ni明显地向茎叶部分转运并累积，5个品种的茎叶部分积累Ni的能力表现出明显差异。

(4) 5个紫花苜蓿品种各部分对重金属Ni的富集系数均表现为：根部远远大于茎叶，根部对Ni的吸收积累能力远远高于茎叶。

(5) 5个紫花苜蓿对Ni的转运系数均未超过1，说明紫花苜蓿的根部对Ni的吸附沉积，减少向上转移，主要通过根际固定作用稳定Ni。在Ni处理浓度为1 μg/ml和9 μg/ml时，三得利品种转运能力最高；在Ni处理浓度为3 μg/ml和6 μg/ml，超人品种转运能力最高。