姬松茸凝集素的分离纯化及性质

2020-06-17王文君王璐瑶

生物加工过程 2020年3期

王文君，王璐瑶，周华，韦萍

(南京工业大学生物与制药工程学院，江苏南京 211800)

凝集素(lectin)是指一种能够专一性识别细胞表面糖基，并且与之非共价、可逆结合的非酶非抗体来源的蛋白质或糖蛋白[1-2]。姬松茸学名为“AgaricusblazeiMurill”(以下简称ABM)，原产自巴西，是一种食药兼用真菌[3]，因其子实体中含有多糖、核酸、甾类和凝集素等多种生理活性物质，同时研究人员发现姬松茸具有抗肿瘤[4]、抗氧化[5]和免疫调节[6]等多种潜在的药理活性，故姬松茸具有良好的应用开发前景。由于食用菌凝集素具有促进有丝分裂、免疫调节、抗增生和抗肿瘤等多种生物活性，目前已成为研究者尤其是免疫学家研究的焦点[7]。近年来，已发现和研究的食用菌类凝集素的数量不断增长，尤其在2000年以后，有许多食用菌凝集素的提取纯化报道[8-9]，但目前关于姬松茸凝集素的研究还比较少。

本文中，笔者拟对姬松茸凝集素的提取工艺进行优化，使用柱层析对姬松茸中的凝集素进行有效地分离纯化，系统研究姬松茸凝集素的理化性质(热稳定性、pH稳定性、金属离子影响、糖结合性能等)，同时研究凝集素对微生物生长的抑制作用，以期为姬松茸资源的综合利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

姬松茸，采购于市场，匀浆机粉碎备用。

(NH4)2SO4(AR)，永华化学科技(江苏)有限公司；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250、丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠、过硫酸钠、四甲基乙二胺(TEMED)(AR)，Sigma公司；Na2HPO4·12H2O、冰醋酸(AR),国药集团化学试剂有限公司。

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、西瓜枯萎菌、绿色木霉及褐腐菌保存于南京工业大学生物与制药工程学院实验室。

pHS-3C型雷磁pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HJ-3型磁力搅拌器，常州国华电器有限公司；TGL-16G台式离心机，上海安亭科学仪器厂；AKTATMexplorer AKTA蛋白纯化仪，GE Healthcare公司；JY92-2D型超声波细胞粉碎机，宁波新芝公司；P25T型聚丙烯酰胺凝胶电泳系统，Biometra公司；G10S型紫外分光光度计，Thermo Acientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姬松茸凝集素的分离纯化

1)凝集素粗品溶液的制备。称取50.0 g粉碎姬松茸干品，用500 mL 0.02 mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)在4 ℃浸泡12 h；浸泡液离心去除固形物，上清液加(NH4)2SO4沉淀(饱和度达到80%)，再次离心后收集沉淀；用PBS缓冲液溶解沉淀，选用1.0×104的超滤膜超滤除盐、浓缩，即得粗样品液，经冷冻干燥获得凝集素冻干粗品。冻干粗品用0.02 mol/L 的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)溶解后离心去除杂蛋白沉淀，上清液即为凝集素粗品溶液。

2)姬松茸凝集素的纯化。采用AKTA蛋白纯化仪，使用DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱层析[10]首先对凝集素粗样进行分离。根据紫外吸收图谱，合并穿透峰和各个洗脱峰。使用兔血球悬浮液测试各峰的凝血活性。收集有凝血活性的样品峰后透析除盐，留备后续纯化。用SP-Sepharose强阳离子交换柱对前述活性样品进行分离，收集有凝血活性的样品峰，透析除盐后用聚乙二醇浓缩后保存，留备后续纯化。用Sephadex G-75分子筛柱对前述活性样品进一步进行分离，收集有凝血活性的样品峰，即得到纯化的凝集素。

1.2.2 凝集素的纯度及分子量的测定

凝集素的纯度通过SDS-聚丙烯酰胺电泳方法测定[11]，分子量采用Sephadex G-75分子筛层析测定[12]。

1.2.3 理化因素对凝集素凝血活性的影响

通过凝血实验检测凝集素的凝集效价，凝集效价指能使凝集反应发生的样品最高稀释倍数。考察不同温度、pH、金属离子等因素对兔红细胞凝血活性的影响。

凝血活性检测方法：稀释后的凝集素溶液加入等量2%兔红细胞悬浮液，室温下静置1 h，观察其凝血活性。

1.2.4 姬松茸凝集素的糖结合专一性测定

稀释后的凝集素溶液，加入25 μL 的糖溶液(80 mmol/L)，静置30 min，加入50 μL兔红细胞悬液，室温静置2 h，测定凝集素的凝血活性，空白对照为凝集素溶液+磷酸盐缓冲液+兔红细胞悬液。选用的糖分别为葡萄糖、蔗糖、乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-果糖、麦芽糖和D-甘露糖。

1.2.5 姬松茸凝集素抑菌活性的研究

采用牛津杯法测定姬松茸凝集素的抑菌活性[13]。菌悬液均匀涂布平板，静置，培养基表面垂直放置2个牛津杯，一个加入200 μL的姬松茸凝集素溶液，另一个加入200 μL的磷酸缓冲液作为空白对照，置于恒温培养箱培养1～3 d，观察其抑菌圈大小。

2 结果与讨论

2.1 凝集素的提取与纯化

2.1.1 DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析

将粗提的凝集素样品进行DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析，用含0.1、0.25和0.5 mol/L NaCl 的Tris-HCl缓冲液进行分步洗脱，洗脱曲线如图1所示。

图1 姬松茸凝集素的DEAE-Sepharose离子交换层析Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of ABM lectin

分别检测图1中的穿透峰D1、0.1 mol/L NaCl洗脱下来的D2和0.5 mol/L NaCl洗脱下来的D4，经检测无凝血活性，而0.25 mol/L NaCl洗脱下来的D3洗脱峰具有很强的凝血活性，收集D3洗脱峰的样品溶液透析除盐，留备后续纯化。

2.1.2 SP-Sepharose强阳离子交换柱层析

将上步收集的活性样品峰透析浓缩后使用SP-Sepharose阳离子交换层析，利用含0.5 mol/L NaCl的乙酸钠-乙酸缓冲液(0.02 mol/L、pH 4.4)梯度洗脱，洗脱图谱如图2所示。再检测图2中各洗脱峰的凝血活性，结果发现C2峰是活性峰，收集C2峰透析除盐，留备后续纯化。

图2 姬松茸凝集素的SP-Sepharose离子交换层析Fig.2 SP-Sepharose ion-exchange chromatography of ABM lectin

2.1.3 Sephadex G-75分子筛凝胶层析

将SP-Sepharose分离后的活性峰样品进一步使用Sephadex G-75分子筛凝胶层析分离，分离图谱如图3所示。检测结果发现B1峰显示出很强的凝血活性，收集B1活性峰透析除盐后冻干，用于纯度及性质测定。

图3 姬松茸凝集素的Sephadex G-75分子筛层析Fig.3 Sephadex G-75 gel filtration chromatography of ABM lectin

2.2 凝集素的纯度及分子量测定

纯化后样品经SDS-PAGE检测，结果见图4。由图4可知，纯化后样品为单一蛋白条带，根据纯化后样品的条带迁移率，计算出纯化得到的亚基分子量为6.0×104。使用Sephadex G-75凝胶过滤法测定其表观分子量，凝集素出峰体积约为125 mL，得其分子量为1.2×105，表明姬松茸凝集素为同源二聚体蛋白[14]。

图4 姬松茸凝集素的SDS-PAGE电泳Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of ABM lectin

2.3 姬松茸凝集素的纯化回收率

姬松茸粗提液经(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE-52阴离子交换层析、SP阳离子交换层析、S-75分子筛层析纯化后，各步骤分离后的姬松茸凝集素回收率及纯化倍数等结果如表1所示。由表1可知，姬松茸凝集素相对粗提液回收率为28.99%，纯化倍数为19.04倍。

2.4 理化因素对凝集素凝血活性的影响

2.4.1 温度对凝集素凝血活性的影响

考察不同温度条件对姬松茸凝集素凝集活性的影响，结果见表2。

由表2可知：从20 ℃开始到70 ℃，姬松茸凝集素的凝集效价没有变化，且保持较高的凝血活性，说明姬松茸凝集素具有较好的热稳定性；在70 ℃以上凝集活性才开始急速下降，直到100 ℃完全丧失凝集活力，说明姬松茸凝集素在高温条件下会发生不可逆转变性，最后活性完全丧失。

2.4.2 pH对凝集素凝血活性的影响

考察不同pH对姬松茸凝集素活性的影响，结果见表3。

由表3可知：在强酸或强碱环境下，姬松茸凝集素的活力会丧失，证明姬松茸凝集素是一种对酸碱均很敏感的蛋白；在pH为4～6时，凝血活性较低，在pH为7～9时，凝血活性较高，说明凝集素对酸的耐受性弱于碱，表明pH7～9是最适pH范围。

表1 姬松茸凝集素的纯化结果

表2 温度对凝集素凝血活性的影响

表3 pH对凝集素凝血活性的影响

2.4.3 金属离子对凝集素凝血活性的影响

测定了3种二价金属离子对姬松茸凝集素活性影响，结果见表4。

表4 金属离子对凝集素凝血活性的影响

由表4可知，姬松茸凝集素对EDTA透析后的去离子缓冲液以及对含Ca2+、Mg2+和Mn2+的3种金属离子缓冲液透析都没有影响它的活性，表明凝集素的凝血活性并不受二价阳离子的影响。

2.5 姬松茸凝集素的糖结合专一性测定

如果凝集素与糖溶液中的糖链结合，就不能与兔红细胞表面的糖链结合，那么对兔红细胞的凝血活性就会有所下降；反之亦然。因此考察不同的糖与凝集素的结合情况，结果见表5。由表5可知，葡萄糖溶液中的姬松茸凝集素几乎没有凝血活性，证明葡萄糖是姬松茸凝集素专一性结合糖，可以高度抑制凝集素和兔血红细胞的凝集反应，D-半乳糖、蔗糖对姬松茸凝集素的血凝活性也起到了部分抑制作用。

表5 凝集素的糖结合专一性测定

2.6 姬松茸凝集素粗提物的抑菌活性测定

2.6.1 姬松茸凝集素粗提物对细菌生长的抑制作用

考察姬松茸凝集素粗提物对细菌生长的抑制作用，结果见图5。由图5可知，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌2种菌株生长的平板上，添加凝集素样品的牛津杯周围没有出现抑菌圈，说明姬松茸凝集素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌并没有显示出抑菌作用。

2.6.2 姬松茸凝集素对真菌生长的抑制作用

考察姬松茸凝集素粗提物对真菌生长的抑制作用，结果见图6。由图6可知：在西瓜枯萎病菌、绿色木霉和黑曲霉生长的平板上，添加凝集素样品的牛津杯周围没有出现抑菌圈，且各菌体都生长旺盛，表明姬松茸凝集素对西瓜枯萎菌、绿色木霉和黑曲霉的生长没有抑制作用；而在接种褐腐菌的平板上，添加凝集素样品的牛津杯周围的菌体生长完全停止，边缘较光滑，出现了明显的抑菌圈，这表明姬松茸凝集素粗品对褐腐菌有明显的生长抑制作用。

3 结论

选用柱层析法对姬松茸凝集素进行了分离纯化，使用了DEAE-Sepharose FF弱阴离子交换层析、SP-Sepharose 强阳离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶层析对姬松茸凝集素进行了有效提取，经SDS-PAGE变性电泳检测纯化后所得的姬松茸凝集素为单一条带；经SP-Sepharose凝胶过滤法分析发现姬松茸凝集素是一种含有2个相同亚基的同源二聚体蛋白，分子量为1.20×105，姬松茸凝集素相对粗提液的回收率为28.99%，纯化倍数为19.04倍。

研究表明，姬松茸凝集素具有良好的耐热性，其最适pH为7～9。姬松茸凝集素的凝血活性不受金属离子的影响，葡萄糖是其专一性结合糖。通过对姬松茸凝集素粗提物抑菌性能的考察，发现该凝集素对褐腐菌有明显的生长抑制活性，展示出其在植物防治领域潜在的应用前景。