由肠炎沙门氏菌引起的交叉污染半定量风险评估工具参数确定

孙琳珺，胡丽丽，田世红，王 翔，刘 弘，罗宝章，宋 夏，杨京津，董庆利

(1.上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093；2.上海市疾病预防控制中心，上海 200336)

近年来，全球食源性疾病频发，受到公众的广泛关注。2018年，欧盟报道了91 662起由沙门氏菌引起的病例，其中西班牙报道了9 526起[1]。原国家卫生计生委办公厅2015年发布数据，表明全国由致病微生物导致的食物中毒事件显著高于其他危害，发病率占总数的53.7%(3 181/5 926)，其中沙门氏菌是引起食源性疾病的主要致病菌之一[2]，广泛存在于自然界中，尤其存在于畜禽肉与蛋类等食品中[3]。当大量摄入(105～106个/g)时将会引起伤寒和副伤寒、急性肠胃炎等疾病，具有相当高的风险[4]，近年来在陕西省汉中市[5]和四川省成都市[6]的监测中都有沙门氏菌的高检出率。

微生物风险评估(microbial risk assessment,MRA)可从科学角度有效控制食品生产加工过程中可能的微生物危害，降低食品安全风险[7]。微生物半定量风险评估(semi-quantitative microbial risk assessment)是使用评分或赋值的方式或者借助半定量风险评估软件对风险发生的可能性及严重程度进行计算和描述[8]，如澳大利亚的Risk ranger软件[9-10]、荷兰Evers等[11]开发的快速定量风险评估工具(swift quantitative microbiological risk assessment,sQMRA)。sQMRA工具通过分析从零售阶段开始致病菌转移的关键环节，设置包括交叉污染等11个参数，从而推测特定食品-致病菌组合的发病率和感染人数。朱江辉等[12]运用sQMRA工具对2008年9—11月牡蛎中副溶血性弧菌的11个参数进行推演。交叉污染作为引起食源性疾病爆发的重要因素之一，其参数设置至关重要，包括交叉污染比例(Scc/r)交叉污染菌量减少比例(Fcc)以及交叉污染菌量摄入比例(Fei)3个交叉污染参数有待深入探讨。

基于此，本文中，笔者以肠炎沙门氏菌风险评估中2 组典型的食源性致病菌-食品组合(肠炎沙门氏菌-鸡蛋，肠炎沙门氏菌-牛肉)的交叉污染参数为切入点，通过消费习惯法调研和实证研究2种方式对sQMRA工具中的3个交叉污染参数进一步明确，为更好运行工具开展半定量风险评估提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

肠炎沙门氏菌(ATCC13076)，ATCC；鸡蛋、棉签、牛肉、案板、刀具，上海卜蜂莲花超市，样品均放于4 ℃冷藏冰箱中备用；胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤培养基(BPW)、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(HE)、无菌均质袋、手套，青岛海博生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS-S 75SII型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗器械厂；电磁炉，上海慧仪仪器厂；XW-80A 型漩涡混合器，上海精科实业有限公司；Scientz-09型无菌均质器，浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-IC型超净工作台、SPX-250B-II 型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；100～1 000 μL、20～100 μL 移液枪，艾本德公司；JT302N 型电子天平，上海精天电子仪器有限公司。

1.3 菌种制备、介质及样品灭菌

取保藏于-80 ℃的甘油保藏管[13]中的肠炎沙门氏菌移至BPW培养基中进行活化，随后于TSA培养基上进行划线，将已划线平板置于(4±0.5) ℃冰箱中临时保存。使用时在已划线平板上挑取单菌落，接种于BPW培养基中，于 37 ℃、140 r/min摇床中培养16～18 h至稳定期，经生理盐水稀释得到108CFU/mL 的初始菌悬液备用。

试验中对案板、刀具、手套等进行相应灭菌方式见表1。其中鸡蛋和牛肉在灭菌后置于(4±0.5)℃冰箱中储藏备用。

表1 交叉污染试验中各介质的灭菌方式

1.4 两组食源性致病菌-食品组合的Scc/r参数调研

确定肠炎沙门氏菌-鸡蛋，肠炎沙门氏菌-牛肉2组Scc/r参数，通过专家启发法获取交叉污染发生比例[14]并结合上海市消费者习惯调研厨房阶段不同食物烹饪方式占比。其中，肠炎沙门氏菌-鸡蛋组合中的烹饪方式包括煮、炒、生食、蒸、烙、熟食、烤、生吃、其他；肠炎沙门氏菌-牛肉中的烹饪方式包括煮、炒、炸、蒸、烙、熟食、烤、其他。

1.5 肠炎沙门氏菌-鸡蛋的Fcc和Fei参数确定

为确定肠炎沙门氏菌-鸡蛋的Fcc和Fei参数，试验研究蛋壳及蛋液中肠炎沙门氏菌到手套上的转移以及研究手套中肠炎沙门氏菌到熟鸡蛋上的转移。

试验根据实际情况，将蛋壳以及蛋液分为以下两部分试验。

1)将蛋壳样品(2 cm×2 cm)浸泡于载有1 mL初始菌悬液的培养皿中30 s。采用擦拭取样法测定其中一份样品表面带菌量，确定初始接菌量。另一份样品蛋壳置于手套上(2 cm×2 cm)接触15 min，使用无菌钳翻动蛋壳样品，使菌液均匀黏附于手套表面。15 min后移除蛋壳，采用擦拭取样法测定手套表面带菌量[15],计算Fcc参数值。试验重复3次。

2)取蛋液样品24 mL于无菌均质袋中，向均质袋中加入1 mL初始菌悬液，并进行均质。将手套表面(2 cm×2 cm)放入蛋液中，静置15 min，使菌液充分黏附在手套上。静置后取出手套，通过擦拭取样法测定手套表面带菌量[15]，计算Fcc参数值。试验重复3次。

取出已灭菌手套(2 cm×2 cm)于无菌操作台中，接种1 mL初始菌悬液于手套，静置15 min。静置后对手套进行3种不同清洁方式处理(S1：不清洗、S2：500 mL无菌水清洗沥干、S3：500 mL洗洁精水清洗沥干)。将手套覆盖于去壳熟鸡蛋表面(2 cm×2 cm)静置15 min。静置后取出手套，通过擦拭取样法测定熟鸡蛋表面带菌量[16]，计算Fei参数值。试验重复3次。

1.6 肠炎沙门氏菌-牛肉的Fcc和Fei参数确定

针对于肠炎沙门氏菌-牛肉的Fcc和Fei参数确定，测定生牛肉中肠炎沙门氏菌到3种厨房器具(刀具、案板、手套)的转移以及单一介质和组合介质(图1)中肠炎沙门氏菌到牛肉的转移。

*假设在一种介质转移到另一种介质当中时，带菌牛肉转移到介质上的菌量与介质转移至牛肉的菌量相同图1 7种场景下不同介质组合方式Fig.1 Combination mode of different media under seven scenarios

称取 25 g无菌牛肉样品放置于均质袋中，移液1 mL初始菌悬液与样品表面，静置15 min，确保菌液均匀黏附在其表面。取出样品加入225 mL生理盐水后均质，测定其初始接菌量。其余样品分别放置于3种介质(刀具、案板、手套，5 cm×5 cm)上，使用无菌钳翻动数次，使菌液重复黏附在介质上，静置15 min[15]。通过擦拭取样法测定介质表面菌量，计算Fcc参数值。试验重复3次。

在3种不同的介质(刀具、案板、手套，5 cm×5 cm)上接种1 mL初始接菌液，静置15 min，将25 g无菌熟牛肉样品分别接触单个介质或者多个介质。测定接触后熟牛肉菌量[15]，计算Fei参数值。试验重复3次。

1.7 参数计算以及统计分析

Scc/r、Fcc和Fei这3个参数计算见式(1)～(3)。

Scc/r=PpAc

(1)

式中：Scc/r为阳性样品发生交叉污染比例；Pp为阳性样品发生交叉污染的概率；Ac为特定烹饪方式占该食品所有烹饪方式的比例。

(2)

式中：Fcc为交叉污染菌量减少比例；N0为初始阳性样品污染浓度；N1为接触介质与阳性样品接触后带菌量。

(3)

试验均进行了2次平行，3次重复。试验中菌量测定均参照GB4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[17]，最终结果以平均值±标准差来呈现。采用SPSS (IBM SPSS Version 17.0)软件对参数值进行显著性检验。通过配对T检验进行组间显著性比较(P<0.05)。使用Origin(OriginLab Version 8.0)进行作图。

2 结果与讨论

2.1 两组食源性致病菌-食品组合的Scc/r参数调研

根据公式计算结果，两组食品-致病菌的Scc/r参数范围为0.11%～44.85%。具体Scc/r参数值见表3。

表3 两组食源性致病菌组合的Scc/r参数值

2.2 肠炎沙门氏菌-鸡蛋的Fcc参数以及Fei参数确定

图2为鲜蛋不同部位中肠炎沙门氏菌的Fcc参数。由图2可知，鲜蛋中肠炎沙门氏菌的Fcc参数值为(2.59±0.28)%、(4.18±0.16)%。鲜蛋中细菌转移率均较低，且蛋壳表面的转移率略高于蛋液。2个场景下的Fcc参数值经过显著性检验发现蛋壳和蛋液的Fcc参数具有显著性差异(P<0.05)。这可能是由于不同粗糙程度对于细菌转移的影响，粗糙介质更有利于细菌的转移，这与Vorst等[18]研究结果相一致。

图2 不同鲜蛋部位中肠炎沙门氏菌的Fcc参数Fig.2 Fcc parameters of Salmonella enteritisin different eggs sections

图3为在不同场景下鲜蛋中肠炎沙门氏菌的Fei参数。由图3可知，3种场景下Fei参数值范围为(0.02±0.00)%～(0.33±0.01)%，参数值都较低且呈现逐渐降低的趋势。不处理、无菌水清洗以及洗洁精水清洗3组操作之间均存在显著性差异(P<0.05)。结果表明，清洗处理可大大降低肠炎沙门氏菌的转移量，Robinson等[19]通过试验也发现肥皂洗手或者使用手套可以在准备食物阶段大大减少细菌的转移。多个研究都证明了这一点[20-23]。但是并不能完全去除致病菌的残留，这可能是由于细菌黏附在介质表面的缘故。

图3 不同场景下鲜蛋中肠炎沙门氏菌的Fei参数Fig.3 Fei parameters of Salmonella enteritisin different scenarios

2.3 肠炎沙门氏菌-牛肉的Fcc参数以及Fei参数确定

图4为不同接触介质下牛肉中肠炎沙门氏菌的Fcc参数。由图4可知，3种接触介质下Fcc参数范围为(43.68±9.16)%～(71.03%±16.82)%，3种介质的Fcc参数值经过显著性分析均无显著性差异(P>0.05)。但是三者的参数值都呈现细菌的高转移率，其中手部的Fcc参数值最高，高达(71.03±16.82)%，刀具与案板的Fcc参数值相近。可见操作者操作对于肠炎沙门氏菌的转移具有巨大的影响。Chen等[24]和Hui等[25]也证实了这一结论，与本试验的结果相一致。

图4 不同接触介质下牛肉中肠炎沙门氏菌的Fcc参数Fig.4 Fcc parameters of Salmonella enteritisin beef in different media

图5为单一介质及组合介质牛肉中肠炎沙门氏菌的Fei参数。由图5可知，单一介质及组合介质条件下，Fei参数值范围为(17.63±6.75)%～(60.49±15.19)%，在单一介质情况下的手套的Fei参数值与刀具、案板的参数值具有显著差异性(P<0.05)。3种介质都受到污染的Fei参数值最高，除了与手套接触场景外，与其他设置场景都存在显著差异性(P<0.05)。Luber等[26]进行厨房鸡肉准备阶段的交叉污染研究，发现鸡腿与鸡肉转移到手部的转移率分别为2.9%和3.8%，而受污染手部以及用具转移到即食制品的转移率为2.9%～27.5%，与本试验结果有所差异。本试验中牛肉中的沙门氏菌的转移率范围更为宽泛。这可能是因为菌种以及肉类产品的不同导致，同时由于厨房器具的组合也会导致转移率的上升。

图5 单一介质及组合介质牛肉中肠炎沙门氏菌的Fei参数Fig.5 Fei parameters of Salmonella enteritisin beef in different media

3 结论

本研究的结果可以完善快速定量风险评估工具中厨房阶段肠炎沙门氏菌典型组合的相关交叉污染参数，填补原本参数的空缺。在完善参数的过程中，也同时发现交叉污染是重要的路径之一。生熟不分离以及不完全的清洗都可能导致交叉污染的发生，从而引起大面积的食源性致病菌爆发，而操作者的操作规范程度也很大程度上影响了细菌的转移。至此，就交叉污染路径而言，需要更多的食源性致病菌-食品组合对交叉污染参数进行进一步的完善，不同接菌量的食源性致病菌导致的交叉污染情况也需要考虑在内。与此同时，为了更好地使用工具进行半定量风险评估，各地区的烹饪方式以及消费量的数据收集也是今后值得关注的重点。就半定量风险评估整体而言，其余污染路径参数的完善与收集也是需要进一步研究的问题。