纳米铜簇合成与应用在生物医药领域的研究进展

单莲云，任佳姝，王炳熙，陈金龙

(中国药科大学 药学院，江苏 南京 210009)

近年来，由于纳米金属簇(metal nanoclusters，MNCs)诸多独特的化学、物理及生物学特性，已受到各国科学家的高度关注[1]。纳米金属簇是指尺寸小于2 nm，介于原子与传统金属纳米粒子之间，由几个到几十个金属原子组成的相对稳定的聚集体。由于其尺寸和电子的费米波长相近，金属纳米粒子的等离子体共振效应消失，能级分裂，能级谱带不连续，使其具有类分子的性质，如光致荧光、HOMO-LUMO电子转移、氧化还原行为等。除此之外，纳米金属簇合成条件温和、毒性低且生物相容性好等优点，使其成为理想的生物传感和影像材料[2-4]。

目前，科学家们主要集中在对纳米贵金属簇的研究上，如纳米金簇、纳米银簇、纳米钯簇、纳米铂簇等材料上。对于纳米铜簇(copper nanoclusters,Cu NCs)的研究进展相对缓慢，主要由于超小尺寸的纳米铜簇在环境中稳定性差、易氧化和团聚，为实际应用带来了一定的挑战和不便。而鉴于纳米铜簇自身独特的性质和优点，如：铜源储量大、廉价、无毒、合成方法操作简单等，使其成为最具潜力的金属簇研究对象，现今已有越来越多的研究者投入到纳米铜簇的研究中，通过不断改进合成方法和工艺，越来越多的性质优良的纳米铜簇被相继报道，因而具有愈加广阔的应用前景。本文中，笔者介绍了纳米铜簇的主要合成方法、理化性质以及在分析传感、化学催化、生物成像等方面的最新应用进展。

1 纳米铜簇的合成方法

纳米铜簇具有超小尺寸、高比表面能、易被空气氧化等特点，在制备、纯化、存储等过程中，较易获得粒径均匀且稳定的团簇。当前，制备Cu NCs最常见的方法主要有：模板辅助法、化学还原法及刻蚀法；其他合成法还有微波辅助法、电化学法、反相微乳法等。

1.1 模板辅助法

模板合成法是研究者们研究制备纳米金属簇的高效合成方法之一。模板分子可提供特定的空间构型，通过和金属离子的相互作用，对合成的纳米金属簇的尺寸和形态均有可调性。常见的模板分子主要有DNA[5-7]、蛋白质[8-11]、硫醇类化合物[12-16]、树枝状聚合物[17-18]等。

1.1.1 以DNA为模板

在DNA的4种碱基中，胸腺嘧啶与Cu2+有较强的亲和力，因此富含胸腺嘧啶的序列常被用于制备纳米铜簇。Rotaru等[5]首次报道了利用双链DNA(dsDNA)为模板制备纳米铜簇的方法(图1)，在抗坏血酸(AA)和Cu2+的作用下，只有dsDNA可与之反应合成纳米铜簇，而单链DNA(ssDNA)则不能发生反应，并且发现纳米铜簇的尺寸和荧光强度与dsDNA的碱基对数成正比，此后有关DNA为模板功能化的纳米铜簇研究逐步加深。Wang等[6]利用聚胸腺嘧啶为模板合成的纳米铜簇可作为荧光探针来检测多巴胺。Gao等[7]基于dsDNA模板化Cu NCs的荧光性质依赖于聚(AT-TA)的长度，开发了一种新的用于检测DNA甲基转移酶(Dam MTase)的无标记荧光分析法，并且还发现此方法可用于评估和筛选Dam MTase抑制剂。

图1 以双链DNA为模板合成纳米铜簇的示意[5]Fig.1 Synthesis of Cu NCs using dsDNA as template[5]

1.1.2 以蛋白质为模板

蛋白质、多肽等物质中的氨基酸可提供许多与铜相互作用的位点，且具有良好的生物相容性。以蛋白质为模板合成纳米铜簇的方法中，牛血清白蛋白(BSA)是最广泛使用的模板。Rajamanikandan等[8]合成的BSA-Cu NCs可作为精确的荧光纳米探针应用于肌酸酐的光学识别。肌酸酐和BSA-Cu NCs探针之间可形成配位络合物使BSA-Cu NCs的荧光显著降低，该方法成功用于检测尿液(人)样品中的肌酸酐，具有非常好的回收率(97.63%～102.43%)。Wu等[9]设计了一种近红外发射的以变性牛血清白蛋白为模板的纳米铜簇(dBSA-Cu NCs)，用于肝素的痕量检测，检测限(LOD)低至0.26 ng/mL。除BSA之外，还有利用天然丝素蛋白[10]、木瓜蛋白酶[11]合成纳米铜簇的方法。

1.1.3 以硫醇化合物、聚合物为模板

巯基可与Au3+、Ag+、Cu2+等金属离子之间发生相互作用，因此巯基类化合物也是合成纳米铜簇的理想模板。谷胱甘肽(GSH)是这类物质中最常用的模板，Lin等[12]、Patel等[13]等都分别报道了将GSH用作还原剂和保护剂一锅法制备Cu NCs的方法。其他巯基类化合物还有巯基咪唑[14]、硫辛酸[15]、青霉胺[16]等物质，可用于Cu NCs的合成。

高分子聚合物凭借其表面的适当官能团可与各种金属离子、小分子等结合形成复合物的优势，使其可作为合成纳米铜簇的优选模板。Wang等[17]合成的聚乙烯吡咯烷酮-纳米铜簇(PVP-Cu NCs)具有27%的高量子产率；Ling等[18]利用聚乙烯亚胺(PEI)合成的纳米铜簇平均直径为1.8 nm，发射峰位置在480 nm处。

录入患者一般情况、基线实验室指标；分别计算患者 Child、终末期肝病模型（MELD）、MELD-Na、慢性肝衰竭-序贯器官衰竭评估 （CLIF-SOFA）和SOFA评分；记录28 d生存状态、各类并发症。结合患者的既往病史、实验室检查、影像学检查、内镜检查及病理检查等对HBV-ACLF患者既往肝病基础进行再诊断，按照WGO关于ACLF基础肝病类型分为A、B、C型。分析比较不同临床分型HBV-ACLF患者的临床特征，包括实验室检查、临床并发症、28 d生存率及预后影响因素。

1.2 化学还原法

化学还原法是指在铜盐溶液中加入还原剂，将铜离子还原为铜原子再逐渐聚集得到纳米铜簇的方法。Hu等[19]以L-组氨酸(L-His)为稳定剂，AA为还原剂，合成了激发/发射峰在390/485 nm处，平均直径为3～4 nm的His-Cu NCs。Li等[20]首次在室温下使用不同的还原剂(N2H4·H2O、NH2OH·HCl和维生素C)原位嵌入单片蛋壳膜(ESM)中得到橙色(N2H4·H2O)和红色发光(NH2OH·HCl、维生素C)的纳米铜簇(图2)。蛋壳膜是一种双层水不溶性生物膜，是纳米科学中良好的还原剂和稳定剂。以N2H4·H2O作为还原剂为例：实验过程中首先将经过预处理干净的ESM在CuSO4溶液(50 mmol/L)浸泡10 min，此时由于Cu2+与ESM表面官能团的吸附作用，ESM呈现蓝色，弃去过量的CuSO4溶液，将ESM转移到N2H4(85%)溶液中，在室温下5～7 h即可合成橙色发光的Cu NCs@ESM，此纳米复合材料显示出优异的光稳定性和化学稳定性，值得称赞的是，这些路线成本极低、且具有环保、便捷、通用的特点，且已证明它们可被应用于检测Hg2+。Bao等[21]以AA作为还原剂和稳定剂，合成了半胱胺(CA)改性的Cu NCs荧光探针用于水溶液中苦味酸(PA)的测定。Cu NCs-CA探针显示了高灵敏度和选择性，用于测量自来水、湖水和河水等实际样品中的PA性能优越。

图2 以蛋壳膜为基质原位合成纳米铜簇的机制[20]Fig.2 Different synthetic routes for the in situ generation of Cu NCs embedded in monolithic ESM[20]

1.3 化学刻蚀法

化学刻蚀法通常先合成较大的纳米颗粒，再用适合的方法将不发光的纳米材料刻蚀成发光的纳米金属簇。Yuan等[22]研究了基于温和蚀刻环境通过静电诱导相转换的方法，获得强荧光的铜、金、银、铂簇的通用合成方法(图3)。主要包括两个步骤：第一步是在水相中用硼氢化钠(NaBH4)还原分解硫醇盐-金属中间体制备硫醇保护的纳米金属簇，但这种原始的纳米簇是多分散、非荧光且性质不稳定的；第二步是将硫醇保护的纳米金属簇转移到含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的有机相中，有机相可选择甲苯或者己烷。在相转移的过程中，纳米金属簇表面带负电荷的COO-(谷胱甘肽有2个羧基)和带正电荷的疏水盐CTA+通过静电相互作用可实现快速转移。纳米铜簇在室温条件下孵化24 h，即可在甲苯相中观察到强烈的蓝色荧光，其发射峰在412/438 nm，量子产率为3.5%。这种方法有以下优点：首先这是一种可以合成铜、金、银、铂及双金属(金/银、金/铂)簇的通用方法，通过相转移的手段容易实现大规模生产且前后保护配体不发生改变。其次，有机相中的荧光金属簇可以很容易穿梭回水相。例如，在甲苯相中的金属簇溶液中，加入含疏水盐四甲基癸酸铵(TMAD)的氯仿后，疏水的癸酸阴离子D-与硫醇保护的纳米金属簇上的疏水阳离子CTA+快速形成疏水盐(CTA)+D-。去除疏水阳离子CTA+的硫醇保护的纳米金属簇恢复带负电荷状态，使它们能够快速返回水相。最后，用于保护金属簇的配体可扩展为定制设计的多肽，从而有助于该方法的实际应用。

图3 刻蚀法合成纳米铜簇的原理示意[22] Fig.3 Forming Cu NCs by ligand etching method[22]

1.4 其他方法

Pan等[23]在波长为532 nm的纳秒激光脉冲照射下，研究了金纳米颗粒与Cu2+离子之间的抗置换反应，结果发现：可以从CuCl2溶液中提取出平均直径为2 nm的高纯度裸铜纳米团簇。Au纳米颗粒完全转化为Au3+和Au+，这是因为等离子体激元产生的“热电子”克服了Au纳米颗粒和Cu2+离子之间热力学反应的限制。此外，还发现裸铜纳米簇表现出比具有相似尺寸的配体保护的Cu NCs高1 500倍的电催化性能，以实现氧还原反应。Jayasree等[24]通过微波辅助法合成牛血清白蛋白稳定的纳米铜簇(BSA-Cu NCs)可作为胆红素的检测器，合成的BSA-Cu NCs尺寸小于4 nm，发射峰在405 nm处。Wang等[25]利用GSH作为还原剂和稳定剂，通过声化学途径得到了在室温下显示红色荧光的超小尺寸和低毒性的纳米铜簇，合成的Cu NCs展现出良好的顺磁性，有望开发成新的核磁共振成像(MRI)造影剂。

2 纳米铜簇的应用进展

铜簇的荧光特性是由于电子激发态sp带到d带的带间转移，或者是占据最高分子轨道HOMO与最低分子轨道LUMO的带内跃迁。目前，报道的成功合成的纳米铜簇的荧光发射从蓝光到红光，覆盖整个可见光区[26]。常见的有机染料如荧光素，在稀溶液中会产生很强的荧光，但在浓溶液中或在聚集状态下以热振动、碰撞等形式释放能量导致非辐射跃迁，从而使得荧光猝灭，这种现象叫做聚集诱导猝灭效应(ACQ)。而Kwok等[27]发现有些物质在稀溶液中荧光很弱，但在聚集状态时荧光显著增强，这种反常现象为聚集诱导发光效应(AIE)。而纳米铜簇也呈现出良好的AIE现象，进一步拓展了其制备强荧光金属簇探针的应用[28]，被广泛用于金属离子、阴离子、生物大分子等的检测和化学催化及生物标记成像等领域。

2.1 传感器领域

2.1.1 金属离子及阴离子的检测

目前，纳米铜簇已经成功应用于多种金属离子的检测，如Pb2+[29]、Hg2+[30]、Fe3+[31]、Cu2+[32]和Cr4+[14]等，检测的原理为金属离子可诱导纳米铜簇发生荧光共振能量转移，使得传感体系发生荧光增强或淬灭进而达到检测目的，在此之前有诸多总结，本文着重介绍其最新进展，即将纳米铜簇应用于对Al3+、Co2+的检测。Hu等[33]用二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂和配体(图4)，室温条件还原CuSO4水溶液得到橙色荧光的DTT-Cu NCs，其最大发射波长为590 nm，激发波长为360 nm。在Al3+存在下，可明显聚集诱导增强Cu NCs的荧光强度，在此基础上成功开发了一种简单、灵敏、选择性好的荧光传感器，可用于检测食品样品中的Al3+，线性范围为0.01～7.0 μmol/L，检测限为0.01 μmol/L。Boonmee等[34]用半胱胺为封端剂合成了一种单分散、呈球形的纳米铜簇，其检测限低至26.7 nmol/L，且成功测定饮用水样品中的Al3+。此外，Han等[35]开发了室温下制备溶菌酶稳定的Cu NCs(Lys-Cu NCs)，可用于水溶液中Co2+的灵敏检测，检测限为2.4 nmol/L，线性范围为10 nmol/L～0.8 μmol/L。

图4 DTT-Cu NCs用于检测Al3+示意[33]Fig.4 Schematic illustration for the detection of Al3+ based on the DTT-Cu NCs[33]

Hu等[19]使用L-组氨酸作为保护剂合成的纳米铜簇建立了一种新型高灵敏度检测碱性磷酸酶(ALP)活性的荧光探针。该方法合成的Cu NCs在390 nm的荧光激发峰与ALP在410 nm处水解产物的特征吸收带有较好的重叠，可通过内部滤光效应(IFE)导致Cu NCs的荧光猝灭。因此，根据ALP水平与猝灭效率之间的相关性可进行检测，检测限低至0.045 U/L，远低于人血清中ALP水平40～190 U/L，此外，该方法可用于检测加入人血清样品中的ALP水平，在实际诊断应用中显示出巨大潜力。

Zhang等[38]首次证明了磷酸化Cu NCs用于胰蛋白酶检测的应用，由于Cu NCs和细胞色素c(Cyt c)之间的静电相互作用，Cyt c和Cu NCs可分别作为猝灭剂和荧光团。Cu NCs可通过静电和疏水相互作用与带正电荷的Cyt c结合进而有效猝灭Cu NCs的磷光。而在胰蛋白酶存在下，Cyt c被消化，因此保留了Cu NCs的磷光故可用于检测胰蛋白酶活性。为评估所提出方法对胰蛋白酶检测的特异性，进行了一系列竞争性蛋白BSA、单胺氧化酶A(Mao-A)、单胺氧化酶B(Mao-B)、GSH、焦磷酸酶(PPase)和溶菌酶的对照实验，并与胰蛋白酶进行比较，实验结果表明：除胰蛋白酶外，其他蛋白质没有显著改变Cu NCs的磷光从而保证检测的特异性。

Bu等[39]以溶菌酶为稳定剂制备的Cu NCs对胆碱有较高且灵敏的选择性，由此开发的传感器能够在水溶液和浸没的滤纸上进行肉眼视觉检测胆碱，且在人血清和液态奶样品中也显示出优异的检测性能。Han等[40]使用2,3,5,6-四氟苯硫酚(TFTP)作为还原剂和保护剂合成的Cu NCs，通过自组装诱导在590 nm处有强烈的荧光发射，量子产率高达43.0%。利用该传感系统，分析了鱼、虾和红酒中组胺的含量，且制备了基于Cu NCs的发光试纸条用于检测食品中的组胺。

2.1.3 pH与温度检测

Wang等[41]用刻蚀法合成的PEI封端的Cu NCs的荧光信号对溶液的pH波动敏感，随着pH从2.0增至13.2，颜色从无色变为蓝色，荧光强度增加了约20倍，因此可用作pH检测的颜色指示剂。Zhang等[42]合成了水溶性的天然丝素蛋白(SF)稳定的Cu NCs，其荧光发射峰在420 nm处，pH线性范围为6.08～10.05。同时，与低pH 6.08相比，SF@Cu NCs的荧光强度在高pH下增加了约8倍。且在不同的缓冲溶液中也呈现出良好的线性关系。该方法成功用于检测实际水样的pH，从而表明其潜在的应用价值。Zhou等[43]用半胱氨酸(Cys)作为还原剂和封端剂获得的Cu NCs在pH为4～10范围内显示出可逆响应，因此可以用做可逆的pH指示剂。

Ye等[44]提出了一种在癌细胞中原位生物合成Cu NCs的策略，可准确地作为纳米温度计应用于体内癌细胞荧光成像和细胞水平的温度测量。他们发现在MDA-MB-231癌细胞中可自发地生物合成Cu NCs，但在正常细胞(即L02细胞)中不能，所得Cu NCs显示红色荧光发射(610 nm)，平均直径为2.0～2.8 nm，生物合成的Cu NCs荧光信号在MDA-MB-231细胞中温度为20～40 ℃时具有热敏感性，人体直肠温度的正常值为36.9～37.9 ℃，口腔温度(舌下部)平均比直肠温度低0.3 ℃，腋窝温度平均比口腔温度低0.4 ℃，因此人体的生理温度范围在Cu NCs的温度热敏范围内，并且发现其可以在癌细胞中有效积累进而进行生物成像，拓展了Cu NCs在生物医学方面的应用。Huang等[45]使用人工多肽作为模板合成的Cu NCs在10～55 ℃范围内呈现良好的温度依赖关系，荧光强度随温度升高而降低，进一步表明了Cu NCs作为温度传感器的应用。

2.1.4 抗生素检测和杀菌

Wang等[46]以多巴胺为模板，用NaBH4为还原剂制得的Cu NCs发出蓝绿色荧光，可成功应用于四环素的检测，当四环素浓度在3.6×10-6～1.0×10-3mol/L范围内线性关系良好，最低检测限为9.2×10-7mol/L，并在实际样品牛奶的检测中进一步证实其实用性。Wang等[47]以BSA为基质制备了红色发光纳米铜簇(BSA-Cu NCs)，并实现对黄酮类化合物芦丁的检测，在0.1～100 μmol/L范围内呈现良好线性关系，且成功应用于人血清样品中芦丁的检测和在滤纸上芦丁的裸眼视觉成像检测。Miao等[48]以木瓜蛋白酶为保护配体制备了发红色荧光的Cu NCs(图5)，并发现Cu NCs与较低浓度的H2O2相互作用能起到良好的杀菌作用，同时证明H2O2与Cu NCs反应过程中被转化成了羟基自由基(·OH)，利用产生的·OH具有高效杀菌活性的优良特性，成功建立了H2O2与Cu NCs的杀菌消毒体系，并在以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性细菌和以大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌的实验中验证了其优越的杀菌效力，同时在小鼠伤口的杀菌消毒实验中，应用该体系处理的伤口在48 h后几乎完全愈合，未发现水肿和红疹，进一步拓展其作为抗菌材料的应用。

图5 纳米铜簇用于提高H2O2抗菌活性的示意[48]Fig.5 Schematic diagram of Cu NCs for improving the antibacterial of H2O2[48]

2.2 化学催化

金属物质如金、银、铜在自然界中可以稳定存在，但当它们的尺寸降低至纳米级别，由于其超小的尺寸和较高的比表面积使其展现出良好的催化活性[20,49]。Hoty等[49]研究了Cu13团簇对H2离解的催化行为，并证明了有限尺寸效应可以在纳米铜簇中产生显著磁矩，团簇的几何高对称性和量子尺寸效应使Cu13具有大的磁矩，从而导致依赖于磁化的催化行为，这种对磁化的依赖可能是磁控制催化活性的途径。

亚甲蓝(MB)是一种吩噻嗪类染料，其作为药物在临床应用上历史悠久且价格低廉，具有解毒、镇痛、抗菌、抗氧化等药理作用，在微生物学和医药学领域发挥重要作用[50-52]。Jia等[53]研究了纳米铜簇在MB与水合肼(N2H4)氧化还原反应过程中的催化作用，MB有氧化型和还原型两种形态，氧化型时呈现蓝色，还原型时为无色。在一定量MB(33 μmol/L)溶液中加入N2H4(60 mmol/L)溶液，二者在无催化剂条件下反应缓慢，混合溶液呈现蓝色，其紫外吸收峰的最大值在654 nm；向混合体系加入一定量Cu NCs(100 μmol/L)溶液，混合溶液颜色在1 min内迅速由蓝色转变为无色，紫外吸收峰也随之消失，测定其反应速率常数为(8.6±0.8)×103L2·mo-2·s-1，表明Cu NCs具有较高的催化活性。随后Li等[20]合成的纳米铜簇在MB与N2H4的反应中也展现了良好的催化性能，进一步证实了纳米铜簇优越的催化性能。

2.3 生物标记与成像

由于纳米铜簇的毒性低，且生物相容性好，因此使其在生物标记与生物成像中有潜在应用。Prakash等[54]首次合成了以2-巯基-1-甲基咪唑(MMI)封端的纳米铜簇(图6)，并且利用人肝癌细胞(HepG2)进行细胞毒性研究，发现纳米铜簇即使在较高浓度(细胞半抑制浓度大于100 μmol/L)下对细胞也无毒性作用，进一步共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)结果表明：Cu NCs的可有效内化，在哺乳动物细胞中保持着可见的荧光特性，具有监测药物递送潜在的应用。He等[11]开发了基于发蓝光的碳点(CDs)和发红光的Cu NCs的双比率型纳米荧光探针。首先通过水热法处理柠檬酸钠和碳酸氢铵可制备蓝色发光碳点(CDs)，然后与3-氨基苯硼酸(APBA)结合制备APBA修饰的CDs；再以BSA为稳定剂，N2H4·H2O为还原剂，制备红色发光的Cu NCs，二者通过碳二亚胺偶联成功得到显示双发射的荧光探针。由于APBA可充当多巴胺(DA)的受体，因此在DA存在条件下，APBA可与DA的顺式二醇之间发生特异性偶联作用诱导CDs表面上DA和APBA的结合，DA触发了电子从CDs到DA的转移，导致复合物中CDs在440 nm处的荧光猝灭，而复合物中Cu NCs在640 nm处的荧光发射峰几乎没有变化，因此实现了DA在水溶液和滤纸上的荧光及裸眼成像应用。

图6 纳米铜簇用于细胞成像的示意[54]Fig.6 Schematic diagram of the Cu NCs for cells imaging[54]

3 总结与展望

纳米铜簇因其在光学、催化、磁学等方面优越的理化性质引起科研工作者们越来越多的关注，使其成为备受瞩目的新型荧光探针。但相较其他贵金属簇而言，对纳米铜簇的研究还相对欠缺，有待进一步深入探索，现今主要集中在以下方面：1)纳米铜簇的稳定性：纳米铜簇的超小粒径和高的比表面能使其在空气中易氧化和聚集限制其应用；2)纳米铜簇的荧光增强及淬灭机制，对纳米铜簇聚集诱导荧光增强和某些物质能使其荧光增强或淬灭的机制研究尚在起步阶段，有待深入探讨；3)纳米铜簇的精准合成，纳米铜簇的合成方法还要进一步优化，使其大小、形貌及表面功能化基团可控。但随着科技的不断进步与对基础研究的深入探索，相信纳米铜簇必将会在众多新型材料中脱颖而出并加强与其他学科的交融，而进一步拓展其在生物医药等领域的应用。