紫云英苷对雷公藤甲素所致小鼠睾丸损伤的保护作用

2020-06-17鲍晓文张铭雅

生物加工过程 2020年3期

张杰，赵昂，鲍晓文，张铭雅，马博

(南京工业大学药学院，江苏南京 211800)

雷公藤甲素被认为是雷公藤的主要活性成分，生物活性广泛，具有抗炎、免疫抑制、抗囊肿和抗肿瘤等作用[1]。但是，雷公藤甲素对机体的毒性严重限制了其临床应用，例如可能会导致男性不育、白血球减少症、月经紊乱，易导致肾毒性和肝毒性[2-3]。其中，雷公藤甲素所造成的生殖功能障碍是最为高发的毒性反应之一。因此，雷公藤甲素常被用来作为模型药物诱发雄性动物的不育模型，其潜在机制可能是雷公藤甲素所导致的睾丸内抗氧化系统损伤，从而造成氧化与抗氧化失衡，使睾丸内部产生大量氧化中间产物，继而引起睾丸细胞凋亡[4-5]。

紫云英苷又名黄芪苷、百蕊草素II，山奈酚-3-O-葡萄糖苷，广泛存在于菟丝子、百蕊草和杜仲等植物中，是主要的活性成分之一，研究表明：紫云英苷具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗氧化及调节机体免疫力等[6-7]。紫云英苷具有缓解远志皂苷引起的溶血作用和抗CCl4肝毒的作用，同时可以提高小鼠体内超氧歧化酶(SOD)活性，降低小鼠肝内氧化应激标志物丙二醛(MDA)的含量以及增加机体抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的含量[8]。

中药菟丝子和杜仲被长期用于治疗男性生殖系统疾病,紫云英苷作为其中的主要活性成分却鲜有相关的报道。因此，本研究采用雷公藤甲素导致小鼠睾丸睾丸损伤模型，研究被雷公藤甲素损伤后，紫云英苷对睾丸指数、睾丸组织学、氧化应激水平的改善，以评价其对小鼠睾丸睾丸损伤的治疗作用。并通过原位末端缺刻标记法(TUNEL)法研究睾丸内细胞凋亡情况及免疫印迹法(Western blotting法)和免疫组化技术检测磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)的表达，以探讨紫云英苷改善雷公藤甲素导致的睾丸损伤的作用机制，以期为进一步开发成为治疗男性生殖系统疾病的药物提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

雷公藤甲素(纯度≥98%)、紫云英苷(纯度≥98%)，上海源叶生物公司；免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；SOD测定试剂盒、MDA测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术公司；一抗p-JNK、β-actin以及二抗，美国丹弗斯Cell Signaling Technology (CST)公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模与分组

昆明种雄性小鼠60只,体质量(25±2)g,将小鼠随机分成3组,每组20只,即正常对照组、雷公藤甲素模型组和紫云英苷组。

各组的具体给药方式如下(给药标准按每10 g小鼠体质量计。)。正常对照组：口服灌胃生理盐水(0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射生理盐水(0.1 mL)；模型组：口服灌胃生理盐水(0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射雷公藤甲素(80 μg/kg，给药体积为0.1 mL)；紫云英苷组：口服灌胃紫云英苷(15、30和60 mg/kg，给药体积为0.1 mL)，0.5 h后腹腔注射雷公藤甲素(80 μg/kg，给药体积为0.1 mL)。按以上方法给药14 d。

1.2.2 睾丸指数

小鼠处死后，立即取出双侧附睾及双侧睾丸，剥离连黏的脂肪组织，迅速称质量并记录湿质量，按式(1)计算睾丸指数。

睾丸指数=睾丸质量(g)/体质量(g)

(1)

1.2.3 睾丸组织的形态学观察

取睾丸放入质量分数为10%甲醛固定液中，沿其长轴垂直于生精小管走向剖开，经石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)染色，置光镜下观察。

1.2.4 睾丸组织SOD活性和MDA含量的测定

取小鼠睾丸低温匀浆后离心取上清，根据1.1项中的试剂盒说明书分别测定SOD活性和MDA含量。取等量小鼠睾丸低温匀浆后提取总蛋白，并用二辛可宁酸(BCA)法进行蛋白浓度测定。利用睾丸的蛋白浓度对相对应的睾丸内的SOD活性与MDA含量进行校正。

1.2.5 睾丸TUNEL染色

小鼠睾丸石蜡切片常规脱蜡至水，滴加20 μL不含DNase的蛋白酶K室温孵育30 min，后加入体积分数3% H2O2溶液孵育10 min以灭活内源性酶，随后滴加50 μL TUNEL 反应混合液，37 ℃孵育60 min。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)复染，磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗，脱水、透明后用含抗淬灭剂的封片剂封片，再在荧光显微镜下观察。

1.2.6 睾丸免疫组织化学检测睾丸组织中JNK(p-JNK)的表达

切片常规脱蜡至水，0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液微波修复10 min; 滴加p-JNK一抗，4 ℃过夜，PBS 缓冲液漂洗2 min,3 次后加生物素化山羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS 缓冲液漂洗2 min，3次后滴加链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC),37 ℃ 孵育20 min。随后使用氧化二氨基联苯胺(DAB)显色并用苏木素轻度复染，最后以中性树胶封片。置于光学显微镜下观察拍照后用Image pro plus 软件进行图像分析。

1.2.7 Western blotting法测定p-JNK在睾丸组织中的蛋白表达

取一定量的睾丸组织，PBS 液清洗3 次，加入蛋白裂解液后匀浆，冰上孵育30 min；4 ℃离心10 min，12 000 r/min 高速离心；吸取上清液即为蛋白液。利用甲酸(BCA)法测定提取蛋白的浓度，制备蛋白样品。恒压模式下行SDS-PAGE 凝胶电泳，恒流湿式电转移法进行转膜；质量分数5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别孵育兔抗p-JNK抗体和内参β-actin抗体，4 ℃过夜。滴加辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗，在 ChemiDocTM XRS+成像系统中采用增强型化学发光法(ECL法)进行化学发光检测,并用 Image LabTM software 对条带进行光密度定性分析。

1.2.8 数据统计

各实验组数据以平均值±标准差(Mean±SD) 表示，采用系统统计软件SPSS 17.0 进行方差齐性检验，方差齐后的各组采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间比较用最小显著性差异法(least-significant difference,LSD)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 紫云英苷对睾丸指数的影响

取各组小鼠双侧睾丸并称质量，考察紫云英苷对雷公藤甲素损伤的小鼠睾丸的质量的影响，结果见图1。由图1可知：雷公藤甲素模型组睾丸指数相对于正常组有显著下降(P<0.01)，说明在雷公藤甲素的毒性作用下，小鼠睾丸发生了明显的病变性萎缩；低剂量(15 mg/kg)紫云英苷即展现出明显的抗雷公藤甲素对睾丸的毒性作用，其显著增加了小鼠睾丸的质量，提高了小鼠睾丸指数(P<0.05)；中高剂量(20 mg/kg)紫云英苷对睾丸的保护作用更加显著，小鼠睾丸质量指数极显著改善(P<0.05)，并趋近于正常，且保护作用呈现剂量依赖性。

图1 紫云英苷对雷公藤甲素诱导的小鼠睾丸指数的影响Fig.1 Effects of astragalin on triptolide-induced mice testis index

2.2 紫云英苷对睾丸组织形态学的影响

通过小鼠睾丸HE染色病理分析，考察紫云英苷对雷公藤甲素造成的小鼠睾丸损伤的影响，结果见图2。由图2(a)可知，正常对照组小鼠睾丸生精上皮厚，细胞层次宽，曲细精管内各级生精细胞排列规则，基底面至腔面可见精原细胞、初级精母细胞、精子细胞等各个发育阶段细胞，腔内可见成熟精子，间质细胞发育良好。由图2(b)可知，在雷公藤甲素的毒性作用下，模型组曲细精管萎缩变形或扭曲成不规则形状，生精细胞数量及管腔内精子细胞数量明显少于正常对照组。模型组睾丸组织形态学的显著病变充分说明了雷公藤甲素对雄性动物的生殖毒性。由图2(c)可知，在低剂量紫云英苷保护作用下，小鼠曲细精管有不同程度的萎缩变形，生精细胞数量及管腔内精子细胞数量明显少于正常对照组，但多于模型组。说明低剂量紫云英苷抗雷公藤甲素生殖毒性的作用已有所体现。由图2(d)可知，中剂量紫云英苷保护组小鼠睾丸曲细精管的变形程度与模型组相比已有明显改善，部分管腔内可见丝状精子细胞各级生精细胞排列规则。说明中剂量紫云英苷已可以保护小鼠睾丸的组织形态，并逐渐恢复雷公藤甲素造成的小鼠生精功能障碍。由图2(e)可知，高剂量紫云英苷治疗组小鼠的睾丸曲细精管较为完整，生精细胞排列有序，层次清楚，间质趋近于正常，精细胞及管腔内精子细胞数量基本正常。说明高剂量的紫云英苷展现出良好的逆转雷公藤甲素所造成的生殖毒性作用，使小鼠的睾丸趋近于正常状态，并已恢复其生理功能。

图2 睾丸组织形态学观察紫云英苷对雷公藤甲素导致的睾丸组织形态损伤的保护Fig.2 Protection of astragalin against triptolide-induced damage of testicular tissue morphology

2.3 紫云英苷对睾丸氧化应激水平的影响

睾丸是产生精子和分泌睾酮的重要器官，其富含线粒体及黄嘌呤氧化酶等生成活性氧自由基的酶类，且具有多量不饱和脂肪酸，使睾丸组织对于氧化应激损伤更加敏感[9]。因此，抑制雷公藤甲素对睾丸的氧化应激损伤成为了减弱雷公藤甲素雄性生殖毒性的重要策略之一。

图3 紫云英苷对雷公藤甲素诱导的MDA 和SOD活性的影响Fig.3 Effects of astragalin on of the level MDA and the activity superoxide dismutase SOD induced by triptolide in mice testis

MDA是膜脂质过氧化最重要的标志产物之一，它的产生能加剧膜的损伤。因此可通过MDA了解膜脂过氧化的水平，反映机体组织内脂质过氧化的程度，并间接反映细胞氧化损伤的程度。SOD是体内主要的抗氧化酶，能够歧化O2-形成H2O2，消除超氧阴离子毒性。因此，笔者通过检测睾丸内MDA含量及SOD活性，考察紫云英苷对雷公藤甲素造成的睾丸内氧化应激的影响，结果见图3。由图3可知：与正常对照组相比，雷公藤甲素模型组睾丸内的SOD活性明显降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)，睾丸内的过氧化环境可能成为小鼠睾丸受损的原因之一。而不同剂量的紫云英苷保护组小鼠睾丸内SOD活性较模型组明显升高(P<0.05)，MDA含量显著下降(P<0.05)。随着紫云英苷剂量的提高，小鼠睾丸内的过氧化状态不断趋于正常的平衡态，即SOD活性的提高和MDA含量的下降与紫云英苷剂量之间呈现出明显的剂量依赖性关系。说明紫云英苷良好的抗氧化作用可以对抗雷公藤甲素造成的睾丸内过氧化，恢复小鼠睾丸内氧化-抗氧化平衡。

2.4 紫云英苷对睾丸细胞凋亡的影响

当机体内活性氧的产生超过抗氧化能力，组织脂质过氧化水平升高，将引起蛋白质表达异常，进一步诱发细胞凋亡[10]。通过TUNEL染色法，考察紫云英苷对雷公藤甲素造成的睾丸内细胞凋亡的影响，结果见图4。由图4可知，TUNEL染色结果中，正常对照组中只可见极少的睾丸间质细胞与支持细胞发生凋亡，雷公藤甲素模型组的凋亡率显著高于正常对照组。紫云英苷对雷公藤甲素造成的睾丸内生殖细胞的凋亡则有明显的抑制作用，且抑制作用具有剂量依赖性。

2.5 紫云英苷对睾丸p-JNK表达的影响

Wang等[11]研究发现：雷公藤甲素在体内外均可破坏睾丸支持细胞内的氧化还原平衡，促使活性氧簇(ROS)水平提高，从而激活JNK通路导致细胞凋亡。通过免疫组化考察紫云英苷对雷公藤甲素诱导的睾丸内p-JNK表达的影响，结果见图5。其中p-JNK免疫组化染色着色于细胞质和细胞膜，免疫组化阳性细胞胞质和胞膜可见棕黄色颗粒，细胞无色或淡黄色为阴性。由图5可知：与正常对照组相比，雷公藤甲素使模型组小鼠睾丸内p-JNK表达量显著上升(P<0.01)；经低剂量紫云英苷治疗后，小鼠睾丸内棕黄色颗粒相较于模型组显著减少，即p-JNK表达量显著降低(P<0.01)；中剂量紫云英苷治疗后，小鼠睾丸内p-JNK表达量显著低于模型组(P<0.01)，且和低剂量组相比也有较大下降；高剂量紫云英苷的保护作用明显逆转了雷公藤甲素对睾丸内p-JNK的上调作用，p-JNK的阳性表达同样显著低于模型组(P<0.01)，使小鼠睾丸组织内p-JNK的表达量趋于正常。

图4 紫云英苷对雷公藤甲素诱导的睾丸细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of astragalin on triptolide-induced apoptosis in testicular cells

图5 免疫组化法紫云英苷对雷公藤诱导的睾丸p-JNK表达的影响Fig.5 The protein expression of p-JNK in triptolide-induced mice testis detected by immunohistochemistry

同时，结合Western blotting法考察紫云英苷对雷公藤甲素诱导的睾丸内p-JNK蛋白表达量的影响，结果见图6。由图6可知，相较于正常组，模型组中雷公藤甲素可使活化的p-JNK蛋白表达量大量提高(P<0.01)。紫云英苷的治疗作用体现在其可以抑制p-JNK的表达，即在低剂量的情况下，小鼠睾丸p-JNK表达量便与模型组形成显著性差异(P<0.05)；并随着给药剂量的上升，中、高剂量组小鼠睾丸的p-JNK表达与模型组相比形成极显著性差异(P<0.01)。其结果与免疫组化结果一致，提示紫云英苷对雷公藤甲素造成的睾丸细胞损伤的保护作用可能与其抑制p-JNK的表达有关。