三疣梭子蟹可食用部位镉组分的逐级提取及分子质量分布特征

田姣姣,林 洪,刘天红,隋建新,王 颖,冯瑞雪,李红艳,曹立民,*

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003;2.山东省海洋生物研究院,山东青岛 266104)

贝类、蟹类等海产品由于滋味鲜美而深受消费者喜爱。但是由于自身的强蓄积特性,这些海产品中的重金属容易富集至很高的浓度,从而导致显著的食用安全风险,其中镉的超标问题尤为突出[1-3],关于其赋存形态及危害评估,一直是研究的重点和热点[4-8],但受限于分离分析手段等制约,迄今关键的科学问题仍未得以明确阐释[9-13]。三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是典型的养殖海产品之一,同样面临镉等重金属所引发的安全危害;与鱼贝类等其它海产品不同的是,其性腺、肝胰腺等(即俗称的“蟹黄”、“蟹膏”)是最受喜爱的可食用部位,恰恰又是重金属富集的主要区域[9,14],从而显著增加了镉形态及其危害分析的复杂程度和难度。

充分、完整地提取分离生物体内不同形态的镉组分,是准确开展风险评估的前提条件。已有研究表明,海洋生物体内有相当数量的镉是与金属硫蛋白等生物分子相结合而存在(metallothionine-Cd等),强酸、有机溶剂、酶的引入,已被证明能导致有机镉复合物的解离而破坏其初始状态或存在提取不完全的现象,比如李敏等[15]的研究证明,有机溶剂对水产饲料镉提取率低于1.6%,而高浓度盐酸(>1%)又会导致有机镉发生解离,在盐酸pH=2.5～3.5(浓度0.025%～0.0025%)的条件下,含镉的水产饲料中镉的提取率为9.01%～10.56%,但该部分镉属于有机镉还是无机游离态离子镉没有表明,无法确定pH=2.5～3.5的盐酸是否造成了MT-Cd解离,廖琳[4]的研究则证明碱性蛋白酶对海豚肝脏镉的提取率只有45%;目前一般采用与生物体生理条件相似的中性Tris-HCl缓冲液进行提取,以最大程度保证镉的形态不发生显著改变[5,9,16],但是对贝类、鱼类等海产品的研究表明,该种方法存在无法将镉提取完全的问题,甚至可能高达60%以上的镉存在于难溶于Tris-HCl的残渣中[10-11]。

目前关于蟹类产品中镉形态的分析,仅有赵艳芳等[9]采用HPLC-ICP-MS确定了金属硫蛋白镉(MT-Cd)、谷胱甘肽镉(GSH-Cd)、半胱氨酸镉(Cys-Cd)等部分含镉组分的存在,但仍未实现充分的分离提取、形态表征及定性定量分析,说明有关海产品镉形态的研究技术仍存在缺陷。本研究拟以三疣梭子蟹可食用部位的镉为研究对象,研究分析Tris-HCl、pH=3.5盐酸、碱性蛋白酶等不同提取体系的逐级提取效果,从中筛选有效的提取分离方法;在此基础上,针对其中主要的镉组分进行分子质量及其分布特征的初步分析,以期为下步更加深入准确地研究阐释镉在蟹类中的赋存形态及食用风险提供技术手段和参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三疣梭子蟹 购于北方沿海某城市农贸市场;1000 μg/mL镉标准溶液(GBW(E)081581) 国家有色金属及电子材料分析测试中心;碱性蛋白酶、5×蛋白上样缓冲液(含巯基还原剂)、彩虹180广谱蛋白Marker、5 mg/mL牛血清白蛋白标准溶液(BSA)、Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、3.5 kDa透析袋、500 Da透析袋 北京索莱宝科技有限公司;10 kDa超滤离心管 Millipore 公司;0.22、0.45 μm醋酸纤维素滤膜 迈博瑞生物膜技术有限公司;实验用水 为超纯水,电阻率18.2 MΩ·cm;实验玻璃器皿 均用硝酸溶液(1+4)浸泡24 h以上,并用超纯水冲洗干净;Tris-HCl缓冲液 为pH7.4,10 mmol/L,含0.1 mol/L氯化钠和5 mmol/Lβ-巯基乙醇。

3k15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司;H1850离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司;SX2-4-10GJ箱式马弗炉 苏州江东精密仪器有限公司;EHD-24电热消解仪 北京东航科仪仪器有限公司;AA-6800原子吸收分光光度计 岛津仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 三疣梭子蟹去掉蟹壳和不可食用部位,取出其肌肉(包括雌蟹的肌肉和雄蟹的肌肉)、雌蟹性腺和雌蟹肝胰腺(二者合称蟹黄)、蟹膏(包括雄蟹的性腺和肝胰腺)等可食用部位,分别匀浆分装,然后于-40 ℃冻存备用。

1.2.2 三疣梭子蟹可食用部位总镉含量的测定 参照国标GB 5009.15-2014《食品安全国家标准 食品中镉的测定》中干法灰化法用马弗炉进行灰化,之后采用火焰原子吸收法测定镉含量,每个部位平行3次,同时做试剂空白。火焰原子吸收法工作参数为:波长:228.8 nm;狭缝:1.0 nm;灯电流:8 mA;乙炔空气流量:1.8 mL/min;背景校正D2。

1.2.3 三疣梭子蟹可食用部位镉的逐级提取 称取2～3 g匀浆样品(肌肉部位3 g,雌蟹性腺、雌蟹肝胰腺、蟹膏分别2 g,精确到0.001 g)于50 mL离心管中,然后加入一定体积(m∶V=1∶5)经4 ℃预冷的Tris-HCl 缓冲液(10 mmol/L、pH7.4),涡旋摇匀后于4 ℃,8000 r/min 下离心30 min,重复提取3次,合并上清液得Tris-HCl提取液[9,17-18]。各部位残渣中加入一定体积(m∶V=1∶5)pH=3.5盐酸,涡旋摇匀后于4 ℃,8000 r/min 下离心30 min,得HCl提取液[15]和雌蟹性腺、雌蟹肝胰腺、蟹膏的残渣。继续对肌肉部位盐酸提取后的残渣进行提取,加超纯水(m∶V=1∶5)均质,NaOH调pH至10,加入3%肌肉质量的碱性蛋白酶,45 ℃水浴酶解30 min,4 ℃,8000 r/min离心10 min,得肌肉酶解提取液和残渣[4,19],用HCl调节pH<7。将各步提取液和残渣分别蒸干,干法灰化,火焰原子吸收法测镉,比较逐级提取不同处理条件下的提取效果。

1.2.4 Tris-HCl提取液中不同分子量镉组分的分离 将Tris-HCl提取液放入截留分子质量为10 kDa的超滤管中,8000 r/min离心10 min,收集残留液用于分析>10 kDa组分;滤出液(<10 kDa)继续放入截留分子质量为100～500 Da的透析袋,加入超纯水(V样品∶V超纯水=1∶20),置于4 ℃静止透析48 h(每隔12 h换一次水),收集残留液用于分析>500 Da组分。另外将Tris-HCl提取液装入截留分子质量为3.5 kDa的透析袋透析48 h(每隔12 h换一次水),分别收集透出液和残留液,结合前述结果用于分析500 Da～3.5 kDa组分及3.5～10 kDa组分。所收集的各部分溶液分别蒸干消化,消化液定容到合适体积,用火焰原子吸收法检测镉含量,计算<500 Da、500 Da～3.5 kDa、3.5～10 kDa、>10 kDa等不同组分中镉的含量及占比。

为了考察超滤效果并分析大分子镉组分与蛋白质的关联性,收集Tris-HCl提取液和10 kDa超滤残留液、滤出液,利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度,然后将各提取液及超滤前后的溶液蛋白稀释至1 mg/mL,按照Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒说明书,制备分离胶、夹层胶、浓缩胶等,上样电泳,电泳结束后进行染色、脱色扫描,操作过程参照文献[20]。

1.2.5 可食用部位总镉含量和逐步提取率的计算 可食用部位中镉含量按公式(1)计算:

式(1)

式(1)中:X为可食用部位中镉含量(mg/kg),C为消化液定容后镉浓度(mg/L),V为消化液定容体积(mL),m为称取可食用部位质量(g)。

可食用部位镉的逐级提取率及残渣剩余率按公式(2)计算:

式(2)

式中:Y为可食用部位镉的逐级提取率(%)或残渣剩余率(%);Mn表示所提取样品在该步提取液或残渣中的镉含量(mg),M总表示所提取样品中的总镉含量(mg)。

1.3 数据处理

数据采用SPSS 24.0数理统计软件进行分析处理及单因素方差分析,P<0.05表示显著性差异,P<0.01表示极显著性差异;采用Origin 8.5绘制图。

2 结果与分析

2.1 三疣梭子蟹各部位的总镉含量

由于难以进行准确有效的分离,雄蟹体内的肝胰腺和性腺等未作进一步区分,而合并作为传统消费习俗中的蟹膏进行分析测试。从三疣梭子蟹体内主要的可食用部位来看,总镉含量为雌蟹肝胰腺(15.662 mg/kg)>蟹膏(13.758 mg/kg)>雌蟹性腺(1.411 mg/kg)>肌肉(0.184 mg/kg)(图1),这与前人的研究结果一致[14,21]。肝胰腺在甲壳类动物中相当于脊椎动物的肝脏,一般认为是重金属蓄积和解毒的主要部位[14],这可能是肝胰腺镉含量高于蟹类的其他可食用部位的主要原因;蟹膏包括雄蟹的肝胰腺和精巢等性腺器官,因此镉含量仅次于雌蟹肝胰腺,但大于雌蟹性腺和肌肉。

图1 三疣梭子蟹可食用部位总镉的分布Fig.1 Distribution of cadmium inedible parts of Portunus trituberculatus

依照我国及许多亚洲国家的习俗,性腺和肝胰腺等均属于可食部位,并有蟹黄酱等相应的加工制品。按照GB 2762-2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定,甲壳类生物体内镉含量≤0.5 mg/kg[22],由此来看单纯的肌肉中镉未超标,而性腺和肝胰腺均超标严重,并导致可食用部位总体的镉含量达到2 mg/kg以上。此外Wiech等[21]针对面包蟹的研究表明,冷冻解冻以及蒸煮等加工流通过程中,肝胰腺内的镉可以迁移至肌肉并由此导致其含量超标。因此,蟹黄和蟹膏等部位的镉含量及形态特征,对于蟹类的安全评价具有重要意义。

2.2 逐级提取对可食用部位镉的提取效果

生物体内镉赋存形态研究中,提取剂多采用中性Tris-HCl缓冲液。本研究的结果显示,对于全部可食用部位整体而言,单一采用中性Tris-HCl能达到约92%的总镉提取率,各部位的提取率则在60.95%～93.93%之间(图2),尤其是性腺和肝胰腺均能达到90%以上。这表明三疣梭子蟹中镉的溶解特性与之前报道的鱼贝类有所不同,之前关于海产品的相关研究中,只有贝类中证实有40%以上的镉存在于Tris-HCl提取液中[10],而鱼类和蟹类中均未有明确的定量分析,例如Heidi等[11]采用Tris-HCl提取鲤鱼和鳗鱼肾脏中的镉,测定出的含重金属片段之和小于总镉含量,赵艳芳等[9]采用Tris-HCl提取梭子蟹体内的镉,HPLC-ICP-MS分离检测鉴定出一些镉的形态,但未将生物体内的总镉与提取出的镉量比较,没有说明是否提取完全。而本研究发现,蟹黄和蟹膏等镉富集程度较高的部位,总体上主要以Tris-HCl提取物存在,通过这一方式既可以较为充分地将绝大多数镉组分提取分离出来,同时可以较为完整地保持其原有形态。进一步采用酸处理和碱性蛋白酶处理,可以将各部位总镉的提取率进一步提高到93%～99%左右(图2),基本达到了完全提取的程度[23],但是考虑到其对于镉复合物赋存形态的潜在破坏,用于下步形态分析、危害评估等研究的价值可能是非常有限的。

图2 梭子蟹各食用部位中镉的逐级提取结果Fig.2 Illustration of the ratio of sequential extractionfor cadmium in different tissues of Portunus trituberculatus

肌肉部位镉的Tris-HCl提取率只能达到60.95%,进一步采用盐酸处理后效果并不明显,仍有37%左右残留,继续经过碱性蛋白酶处理后则可以充分溶出(图2),这也从侧面证明,其赋存形态与内脏和性腺等部位存在明显差异,有相当数量的镉并非以简单的游离状态存在,而是与生物组织紧密结合或者已经成为结构组分,这一点是之前的研究有所忽略的[11]。综上，考虑到Tris-HCl既可以将三疣梭子蟹可食用部位中绝大多数的镉提取出来,且能最大程度不破坏镉形态,故将该部分提取物优先作为后续研究对象。

2.3 Tris-HCl提取物中不同分子质量镉组分的分布

由电泳结果可知(图3A、3B),梭子蟹各部位Tris-HCl提取液中蛋白组分的分子质量均大于24 kDa。依据超滤管(Amicon-Ultra-15,Millipore)的选择和使用原则,截留分子质量不应大于目的蛋白分子质量的1/3。结合市面上现有的超滤管种类,实验中选择截留分子质量为10 kDa的超滤管,来实现蛋白镉等大分子镉复合物与小分子镉复合物的初步分离。肌肉、蟹膏、雌肝胰腺等三个部位的超滤透出液中蛋白浓度均低于0.01 mg/mL(表1),说明采用截留分子质量10 kDa超滤管基本上可将不同部位Tris-HCl提取液中的蛋白超滤完全;而雌性腺的透出液中仍有少量蛋白质残余。这一结果也得到了SDS-PAGE电泳的验证,蟹膏、雌蟹肝胰腺、肌肉等三个部位的透出液(<10 kDa)中均未出现蛋白条带,而雌蟹性腺的透出液中在75～135 kDa之间出现电泳条带,猜测可能是该部位存在较多的大分子蛋白,而且可能不是常见的球形分子,因此有少量未被Millipore超滤管特有的再生纤维素膜(截留率90%以上)有效截留而混入<10 kDa溶液中。

表1 三疣梭子蟹各部位Tris-HCl提取液超滤前后的蛋白含量Table 1 Protein concentrations of Tris-HCl extractsfrom Portunus trituberculatus before and after ultrafiltration

图3 梭子蟹各部位Tris-HCl提取液SDS-PAGE结果Fig.3 SDS-PAGE of Tris-HClextracts from Portunus trituberculatus注:A,B:Tris-HCl提取液;C:>10 kDa组分;D:<10 kDa组分;A:超低分子量电泳;B、C、D:大分子电泳;1:Marker;2:肌肉;3:雌性腺;4:雌蟹肝胰腺;5:蟹膏。

采用超滤结合透析的方式对Tris-HCl提取液中不同分子质量镉复合物的分离测定结果如图4所示,发现各部位分子质量>10 kDa的镉复合物占比最高,分别达到90.8%、49.25%、67.6%、64.6%,表明镉进入生物体内后主要是与一些大分子物质结合,而这可能是大分子物质(如蛋白质等)含有较多的基团-SH、-NH4、-COOH等活性基团所导致,这些基团一般认为具有较强的镉亲和能力[24]。但是这些大分子具体是何种物质,是否全部是蛋白镉需要进一步研究:以往研究较多的金属硫蛋白镉分子质量一般在6～7 kDa,即使发生桥连,也在15～20 kDa左右[17],而从本研究结果来看,提取液中蛋白分子质量主要处于24 kDa以上,因此该类镉组分应较少含有金属硫蛋白镉,或更可能是其它大分子蛋白或者多糖、脂类等与镉形成的复合物,例如廖艳等[13]也在企鹅珍珠贝的体内发现了可能与糖类、脂溶性大分子结合的镉。这一点与之前认为的镉进入生物体主要是与金属硫蛋白结合[25-28]存在明显差异的。

图4 不同分子质量镉复合物在Tris-HCl提取镉中的比例Fig.4 Proportion of cadmium complex of different molecular weight in Tris-HCl extracts注:A:肌肉;B:雌性腺;C:雌蟹肝胰腺;D:蟹膏。

同时发现Tris-HCl提取物中<500 Da的镉组分占比也较大,分别达到了4.50%、5.51%、25.13%、9.36%。目前已发现的离子态镉(Cd2+)、GSH-Cd、Cys-Cd均属于<500 Da小分子镉组分,但其毒性可能存在显著差异,因此明确毒性较大的离子镉(Cd2+)占比,确定其它小分子镉复合物的毒理学特征,将是下步研究重点。除此之外,Tris-HCl提取液中分子量介于500 Da～10 kDa之间的镉组分,在雌性腺部位可达45.14%,但在其余部位均占比较低,其可能含有MT-Cd,也可能是其它未知镉复合物,目前仍难以确定。

3 结论

本文针对三疣梭子蟹肌肉、蟹黄和蟹膏等不同可食用部位中的镉,通过对不同提取方法的效果探究,表明Tris-HCl法具备温和及保留镉赋存形态完整性的优势,其溶于Tris-HCl提取液的镉是梭子蟹可食部位主要的赋存形态,占内脏和性腺的90%以上;而肌肉组织含37%镉需要碱性蛋白酶处理才可释放,表明肌肉中部分镉已经牢固地与肌肉组织缔合在一起,甚至可能已经通过同化作用成为生物结构的组成成分,而这些对于进一步研究探讨海产品中镉的蓄积转化具有较好的提示意义。

基于超滤透析等手段研究Tris-HCl提取物中不同分子量镉组分的分布特征,发现49%以上均属于分子质量>10 kDa的镉复合物,表明梭子蟹中的镉可能与金属硫蛋白以外的其它大分子如蛋白或者多糖、脂类等形成复合物,在金属硫蛋白所介导的途径之外,可能存在其它的蓄积代谢机制;分子质量处于500 Da～10 kDa之间的镉组分占比相对较少,而包含高毒性离子态镉分子质量<500 Da的镉组分约占4%～25%。考虑到有机镉与无机镉之间的毒性差异,三疣梭子蟹中镉的实际危害很可能与之前基于总镉的评估结论有所不同。

重金属在水产品体内的蓄积和分布状况可能受多种因素影响,如生物遗传特性、生活的水质、养殖条件等,不同个体之间可能因此存在差异。因此后续工作仍需要不断进行验证和完善,以更加精准地解析三疣梭子蟹中镉的赋存形态和分布特征。