气液微萃取和GCMS对臭豆腐中挥发性成分提取与分析

叶琳洋,康 琴,李 刚,牟 莉,*

(1.长春大学食品科学与工程学院,吉林长春 130022;2.吉林省食品检验所,吉林长春 130022)

臭豆腐是一种中国传统风味美食,因地域不同,制作工艺也不尽相同。其中,北方以发酵作为主要的制作手段[1-4],而南方则是以油炸作为主要工艺手段[5]。但由于臭豆腐拥有异于其他食品的气味,曾有报道[6]对其气味产生的来源提出质疑,因此本文意在对臭豆腐中的挥发性成分进行研究分析,以探究其香气的主要成分。

近年来,对于臭豆腐中挥发性香成分的提取方法主要包括固相微萃取法[1]、静态顶空[7]、顶空固相微萃取法[8]等。本文采取了较为新颖的提取方法,即气-液微萃取法(GLME)[9]。GLME的装置的简单示意图如图1所示,GLME是基于顶空液相微萃取技术的原理[10],在对样品进行加热同时通过N2将样品中的目标化合物连续吹扫至萃取溶剂中,再利用“相似相溶”原理使目标化合物均匀地分散在萃取溶剂中,相对于固相微萃取(SPME)[1]等常规的前处理方法更容易操作,其不仅实现了待测样品的提取、净化和浓缩一系列前处理操作过程集中一体化,同时还可以在短时间内[11]完成一个样本的提取,提高了分析检测的工作效率。

图1 GLME装置示意图Fig.1 GLME device schematic

本次研究采用GLME对臭豆腐进行前处理同时结合GC-MS,使得臭豆腐中的挥发性香成分在短时间内提取并富集于萃取溶剂中,从而实现了前处理一步操作后即可直接上样进行分析,再通过已存在的相关研究结论做辅助性对比,进而对臭豆腐中的挥发性香成分进行初步探索性研究,以证明GLME可以用于提取臭豆腐中的风味成分。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

臭豆腐 三个市售不同品牌;无水硫酸钠(使用前在400 ℃条件下灼烧12 h,贮于干燥器中,冷却后备用) 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;甲醇 色谱纯,德国Meker公司;石英玻璃棉 奥瑞斯新材料科技有限公司。

气相色谱-质谱联用仪(GCMS-QP2010及GCMS Solution数据处理系统) 日本岛津(SHIMADZU)公司;ME-101气-液微萃取仪 延边大学长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室研制开发;FA25匀浆机 德国弗鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 将市售三个不同品牌的臭豆腐样品编号为01、02、03,分别移取适量样品进行搅拌制为匀浆,按照顺序依次密封,在4 ℃下保存。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:J&W DB-5石英毛细柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:40 ℃保持2 min,以5 ℃/min升至150 ℃,不保持,以15 ℃/min升至280 ℃,保持5 min。

1.2.3 质谱条件 载气:氦气(He),纯度≥99.999%,流速1.78 mL/min。进样量1.0 μL;进样方式:不分流进样,电离模式:电子轰击(EI);轰击能量:70 eV;GC-MS接口温度:300 ℃;离子源温度:230 ℃。全扫描模式,质量扫描范围:m/z 29～500,溶剂延迟2.5 min。

1.2.4 GLME操作 称取0.10 g臭豆腐样品于填装有石英玻璃棉以及适量无水硫酸钠的样品管中,接着将样品管移至样品池内,并用橡胶隔垫使样品池密封;取50 μL醇萃取相添加至200 μL的内衬管中作为接受相置于冷凝槽内;设定GLME条件为萃取温度:268 ℃、气流流速:2.5 mL/min、冷凝温度:-2 ℃、萃取时间:7 min;运行GLME程序至设定时间终止后,洗脱并定容接受相体积至100 μL,涡旋震荡使样液混匀,最后经气相色谱-质谱分析研究。

1.2.5 SPME 操作 取搅匀的02号样品20 g置于40 mL的固相萃取瓶中,在50 ℃的水浴中加热20 min,待顶空平衡后,将萃取头插入瓶中,在50 ℃顶空下吸附30 min,取出萃取头,在GC-MS下解析。

1.3 数据处理

利用NIST 08谱库对总离子流色谱图进行检索定性鉴定出各成分(相似度≥80%),对不同品牌臭豆腐之间的挥发性香成分进行对比分析。

2 结果与分析

2.1 三种臭豆腐挥发性香成分总离子流色谱图

利用GLME-GC-MS得到的三种臭豆腐挥发性香成分总离子流色谱图分别由图2、图3、图4表示,具体的鉴定结果(相似度≥80%)在表1、表2和表3中进行相关解释。

图2 01号臭豆腐样品中挥发性成分总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of volatilecomponents in No. 01 stinky tofu sample

图3 02号臭豆腐样品中挥发性成分总离子流色谱图Fig.3 Total ion chromatogram of volatilecomponents in No. 02 stinky tofu sample

表1 01号臭豆腐样品中挥发性香成分的GC-MS分析结果Table 1 GC-MS analysis of volatile aroma components in No. 01 stinky tofu samples

图4 03号臭豆腐样品中挥发性成分总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of volatilecomponents in No. 03 stinky tofu sample

2.2 三种臭豆腐的挥发性香成分分析

根据NIST 08谱库对图2、图3、图4中对成分进行鉴定,其结果如表1、表2、表3所示。

表2 02号臭豆腐样品中挥发性香成分的GC-MS分析结果Table 2 GC-MS analysis of volatile aroma components in No. 02 stinky tofu samples

表3 03号臭豆腐样品中挥发性香成分的GC-MS分析结果Table 3 GC-MS analysis of volatile aroma components in No. 03 stinky tofu samples

在臭豆腐这类发酵型食品中,酸类物质既是发酵原料,又可提供特殊香气。表1中酸类化合物峰面积占比最大这一结果也可以佐证;在01号样品中,胺类物质占比相对较高,这类物质因N元素存在而具有特殊气味,其可能是原料大豆在发酵过程中形成的;其次,醇类的存在令臭豆腐的风味更淳厚[1-2];酯类令其有果香或酒香[5];酮类物质通常赋予食品果香[2];苯酚在增香的同时还可以杀菌[1];杂环类物质中,吲哚的存在赋予臭豆腐特殊的臭味;烷烃类则对于臭豆腐风味的贡献较小,由此可知,正是这种多样的风味成分构成了臭豆腐的特殊风味。

由表2可知,酸类占比最大,酯类次之,而在02号样品中,醇类并未被检出,最大的可能是在臭豆腐的制作过程中,由于酸类成分较多,醇类在加工时参与了酯化反应,使得样品更多地体现出酯类的酒香;与01号样品相比,02号样品的风味物质中有二甲基三硫参与,其赋予臭豆腐臭萝卜的气味[8],在吲哚存在的同时,这种混合挥发性成分的存在使得臭豆腐更具特异性风味。

根据表3可知,与01、02号样品相似,03号样品的酸类占比重最大,其次是胺类,同时有醇类、酯类和酮类化合物,这会使臭豆腐的特殊香气更浓郁;在杂环类中均为含氮类化合物,其中,肟类物质是由含羰基化合物与羟胺作用而形成的,结合表3的分析结果推断该化合物的出现可能是加工过程中的副产物,此外,吲哚的存在会令臭豆腐在嗅觉上产生令人不愉悦的臭味[5]。

3个样品经GLME提取并通过GC-MS分析后,将各样品的主要挥发性成分进行整理,结果如表1～表3所示。再通过图5比较3个样品之间贡献香气的化合物类别,发现本实验所鉴定出的3种臭豆腐中挥发性香成分之间存在较大的差异。在01号样品中,共检出8类22种挥发性香成分,其中醇类3种、酸类3种、酯类4种、胺类6种、酮类2种、杂环类化合物2种、酚类1种、以及烷烃类1种;在02号样品中,共检出酸、酯、胺、酮、杂环化合物、腈、硫化物7类、29种化合物;在03号样品中,共检出酸、醇、酯、胺、酮、酚、杂环化合物、腈、烷烃以及氨10大类、43种化合物。整理后发现本次研究中所检出的结果与已有文献[1-2]中的结果有所差异,在相关文献中所鉴定出的醇类物质较多,几乎没有鉴定出胺类物质,然而在本文中鉴定出较多的胺类物质,所鉴定出的醇类较少。其可能的原因一是与产品的产地和原材料之间存在差异有关,二是与不同的前处理方法相关。GLME是短时内的提取方法,化合物的损失可能会小于常规长时间提取方法;GLME是在较高温度下进行提取过程,相对于较低的水浴温度提取方法而言,也可能会存在不一样的产物。

图5 3种样品挥发性成分类别统计图Fig.5 Statistical chart of volatilecomponent categories of three samples

2.3 三种样品中主要挥发性成分分类分析

2.3.1 酸类化合物 在发酵过程中,有原料大豆的脂类水解反应,其主要产物就是酸类物质,同时还会有使臭豆腐产生独特气味的酯化反应;另外在自然发酵过程中也会产生一部分的酸[12],这是臭豆腐中酸的最可能的来源。酸类化合物的存在会令臭豆腐的背景风味更独特[13]。3个样品中均检出乙酸,乙酸在发酵型食品中既是调味剂,又是酯化反应中最常用的原料,因此在臭豆腐中乙酸的相对含量会较高。在01号样品中酸类物质也有很高的香气贡献,在02、03号中酸都是贡献最大的化合物。3个样品中02号样品酸的相对含量最大同时种类也最多,共包含了10种酸,其中检出了另外2个样品中未检出的异戊酸,异戊酸具有腐烂水果的气味[14],同时有研究证明[15]它还和酒精发酵相关。经比较发现不同品牌的臭豆腐成分之间存在一定的差异。

2.3.2 醇类化合物 在3个样品中,检出的醇类物质种类都很少,可能是因为在发酵过程中醇几乎完全用于与酸发生酯化反应,而且本次研究中的提取溶剂是甲醇,可能对提取以及检出过程存在一定影响。01号中检出3种,02号未检出,在03中检出2种,3者之间检出的醇类有很大差别。在01号中,醇类中相对含量最大的是糠醇,糠醇具有硫化物的酯香、霉香、甜香的发酵味道[16-17];而在03号中检出了香叶基芳樟醇,这是一种具有木香气味的化合物[18],其最可能的来源是样品原料中添加的香辛料。在臭豆腐中,醇类物质虽然检出种类少,但却具有独特的气味可以起到助香作用。

2.3.3 酯类化合物 在传统臭豆腐发酵过程中通常以酒曲作为原料,因此在制作过程中最为常见的就是醇酸酯化反应,酯类为臭豆腐提供了花香、果香或者酒香的香气[2]。在01和02号中都存在丁位壬内酯,这是一种具有类似坚果、奶油的香气[2]的化合物;03号中是2种氨基酸发生酯化反应的产物,其最可能的来源是原料大豆在水解过程中与醇类物质反应而得到的产物。

2.3.4 胺类化合物 胺类化合物也对臭豆腐提供了一定的香气贡献,并且大多数胺类化合物均有腐败、腥臭味,这会对臭豆腐的特征性香气更加透发。在其他相关文献中胺类化合物几乎没有被提及[1-2],原因可能是胺类的含量微乎极微,在前处理过程中可能被剔除掉,而在GLME的处理下即使相对含量很低的胺类化合物被提取且检查出来,证明GLME在挥发性物质的提取工作中具有一定的优势;在01号中有6种,02号中存在7种,03号包含17种。在3个样品中均含有丁二酰亚胺,但在相关文献中并没有介绍[5,8],如若将其判定为臭豆腐的一种特征性香气物质还需更详细的研究。

2.3.5 杂环类化合物 杂环类化合物种类较复杂,但在臭豆腐样品中多数都是含有氮元素的杂环,并且大都具有特殊的香气特征,这可能与臭豆腐的制作过程中的大豆发酵相关。其中在3种样品中均含有吲哚,吲哚作为一种香料,在一定的浓度范围内会呈现出特殊的臭味,这对臭豆腐具有特殊香气提供了主要贡献。由本实验以及过往文献[1-2]可以推断吲哚是臭豆腐中的特征挥发性香气之一。

2.3.6 酮类化合物 酮类化合物能够令臭豆腐的香气透发[1],在臭豆腐中,酮类物质最可能的来源是:多不饱和脂肪酸发生氧化或降解反应得到的产物以及发酵过程中微生物代谢的产物[19]。在3种样品中检出的酮类化合物种类都很少并且相对含量较低,因此在臭豆腐中更多的是起到香气辅助的作用,比如3种样品中均检出的2-吡咯烷酮,根据文献知,2-吡咯烷酮与烤制类食品的香气有一定关联[20]。但这一化合物的相对含量低,在相关臭豆腐的挥发性香成分的文献中未有提及,这可能与提取方式相关,但仍需更多的实验进行作证。

2.3.7 其他类化合物 在臭豆腐样品中还检出了酚、腈、烷烃、硫化物以及氨类化合物。对于酚类化合物,在01号中检出苯酚,苯酚作为一种香料既为臭豆腐提供增香效果还拥有对食品杀菌、防腐的功效[1],这对于产品的贮存起到一定作用;在03号中检出了2,6-二甲氧基苯酚也是具有木香气味的化合物[21],通常会在熏制食品中检出;烷烃类化合物的存在可能与传统自然发酵过程相关,在大多的发酵型臭豆腐中都会添加如花椒等的香辛料[22],01号样品中烷烃的相对含量较低,在对臭豆腐的挥发性香气贡献上并没有很大的作用;腈类化合物,查阅文献可知,苯代丙腈是腌渍雪菜中的一种特征香气物质[23],因此在样品中出现很可能是原料中包含类似雪菜的物质,而正十六腈被检出很可能是样品中的饱和烷烃与含氮化合物之间发生反应的产物;在02号中还检出了一种含硫化合物——二甲基三硫,在已有相关研究中几乎都会检出该化合物[1-2],这种化合物具有臭萝卜、洋葱的气味,添加二甲基三硫等硫化物会使得臭豆腐的特征气味更加浓郁,让人印象更深刻;同时还检出了1个氨类化合物—二异戊基氨,同样在相关研究中未被提及,可能是在提取过程中含氮化合物参与了某种反应得到或者是其提取含量较低而被其他物质掩盖。

2.4 臭豆腐挥发性香气物质主成分分析

由于挥发性成分类别较多,为了更直观简明地分析比较各数据,通过主成分分析法(PCA)比较各类挥发性成分对臭豆腐的贡献,结果由表4、图6表示。

表4 因子总方差分析结果Table 4 Results of factor total variance analysis

图6 旋转空间成分图Fig.6 Composition diagram of therotating space

由表1～表3可知,臭豆腐的挥发性成分最多可以分为11类,但各实验样品间的结果也存在差异。为了找出代表性的挥发性香成分,因而对臭豆腐样品的挥发性成分进行主成分分析。表4是对01～03号样品中各官能团(即因子)之间的总方差分析结果。

由表4,第一主成分和第二主成分的特征值分别是7.984和3.052,累计贡献率累计100%,第一主成分72.254%,第二主成分为27.746%。在一般情况下,当主成分累计贡献率≥85%,即可利用主成分代表原始数据[24]。经分析臭豆腐的第一主成分分别是酮类、腈类、酸类、烷烃、硫化物、醇类、酚类以及酯类,第二主成分为杂环类化合物、氨类和胺类。图6是臭豆腐样品旋转空间成分图,即是通过在二维空间上将所分析的两个主成分的特征值和特征向量通过一定的旋转角度反映出来,经旋转后可以将样品中的致香官能团的数据浓缩在二维空间中,可以更明确直观地表示第一主成分与第二主成分中挥发性香成分对臭豆腐所产生影响的异同。其中,第一主成分分为三簇,即酯类、硫化物、酸类和腈类为一簇,酚类、醇类以及烷烃为一簇,酮类单独为一簇;第二主成分每一类别均单独为一簇,同样共计三簇。对所提取的两个主成分的PCA分析结果如表5所示,表5是反映经SPSS处理后的第一、第二主成分的特征向量的系数,在第一主成分中呈正相关关系较高的官能团类别有酮类、腈类、酸类和酯类,烷烃则表现出较高的负相关;第二个主因子中杂环和醇类有较高的正相关关系,氨类表现出较高的负相关。再由表4中前两个主因子的总方差贡献率高于50%可以推断,酮类、腈类、酸类、酯类、烷烃、杂环类、醇类以及氨类为臭豆腐挥发性香气中的特征官能团类别。

表5 臭豆腐主成分矩阵得分系数Table 5 Matrix of scoring coefficients ofprincipal components of stinky tofu

2.5 前处理方法比较

GLME作为一种新颖的前处理方法,还并未有利用这种技术对臭豆腐中挥发性成分提取的相关研究。为了判断GLME是否可以用于对臭豆腐中的挥发性成分进行提取,本文选取了SPME与GLME对同一样品进行提取,经GC-MS分析鉴定提取成分,结果如表6所示。SPME对02号臭豆腐样品处理并经GC-MS分析结果如图7所示。

表6 SPME与GLME提取02号臭豆腐样品挥发性成分的GC-MS分析结果Table 6 GC-MS analysis results of SPME and GLME extracting volatile components of No. 02 stinky tofu samples

续表

图7 利用SPME提取02号臭豆腐样品中挥发性成分总离子流色谱图Fig.7 Total ion chromatogram of volatile componentsin No. 02 stinky tofu samples extracted by SPME

注:“-”在相对含量中表示未检出。

对SPME与GLME方法提取同一样品的分析结果之间的比较见表6,SPME共鉴定出23种成分,GLME鉴定出29种成分,其中二者均鉴定出的成分共5种,分别为乙酸、丙酸、丁酸、吲哚、二甲基三硫。对二者的检出成分对比可知,GLME单独检出了胺类、腈类,而SPME检出了醇类、酮类、醛类、酚类。这种检出的差异性可能是由于提取温度条件不同所致。GLME的提取温度是由低温不断升温至指定温度,并在指定温度下保留相应的时间对样品进行萃取[10],例如像胺类等这类化学基团较复杂的化合物可以被提取出来,而SPME是在较低且恒定的提取温度下对样品进行提取[2],因此对于一些高气化点的风味物质难以提取被鉴定出来。同时,分析共同鉴定出的5种成分的占比可知,GLME的结果要高于SPME。推测GLME相对于SPME而言,具有高效、节约成本、提取效果好的优势,因此GLME可以用于提取臭豆腐中的挥发性成分。

3 结论

3个样品经GLME-GC-MS分析,鉴定出酮类、腈类、酸类、烷烃、硫化物、醇类、酚类、酯类、杂环类化合物、氨类和胺类11大类物质。经PCA分析可得,臭豆腐挥发性香气中主要致香的官能团为酮类、腈类、酸类、酯类、烷烃、杂环类、醇类以及氨类。根据3种样品间的对比,对臭豆腐的挥发性成分贡献较大的有吲哚、丙酸、丁酸,二甲基三硫等。

本次研究还可以证明GLME相比较常规的前处理方法,可以快速地提取被检测成分,提高了检测效率。因此,GLME作为一种新型的前处理方法,可以有效地提取样品中较为复杂的成分,这将有利于食品的快速检测,为样品的前处理提供更加便捷、高效的手段。