菠萝蛋白酶金纳米簇模拟酶活性比色法检测Hg2+

刘士蒙，李嘉倩，吕昌银，刘然，李诗雅，杨桂英

(南华大学 公共卫生学院 衡阳市健康危害因子检验检疫新技术研究重点实验室，湖南 衡阳 421001)

近年来，纳米材料的快速发展为开发人工模拟酶提供了新思路[1]。纳米酶广泛应用于免疫测定和生物传感器等领域。其中，金纳米团簇，由于其毒性低，生物相容性好，催化性能优异，已被广泛用于生物检测[2]。菠萝蛋白酶(Bromelain)属于巯基蛋白酶，是一种植物源性蛋白质[3-4]，是制备金属纳米团簇的理想模板，且很少应用于纳米材料合成。

Hg(II)离子通常被认为是毒性很强的重金属离子，严重危害人类健康和生活环境。因此，Hg2+的灵敏检测对于监测水环境非常重要，已经开发了高效液相色谱法[5]、原子吸收光谱法、ICP-MS法、冷蒸气原子荧光光谱法[6]等来检测Hg2+。然而，这些方法仪器昂贵，样品制备过程耗时、复杂，限制了在现场分析中的应用。

本文建立了检测环境水样中Hg2+的新型比色传感新方法，具有低成本、高选择性、简便等优点，并成功应用于环境水样中Hg2+的检测。目前，没有发现单独使用菠萝蛋白酶作为模板合成金纳米簇，利用其模拟酶活性检测金属离子的报道。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

菠萝蛋白酶(Bromelain)、氯金酸(HAuCl4)、汞标准溶液(100.0 μg/mL)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、双氧水均为分析纯；实验用水均为灭菌超纯水(电阻为18.25 MΩ·cm)。

UV-2550紫外-可见分光光度计；THERMO-SHAKER恒温混合器；Titan G2 60-300透射电子显微镜；K-Alpha 1063 X射线光电子能谱仪；HGG-1102远红外线鼓风干燥箱。

1.2 Bromelain-AuNCs的合成

取90 μL HAuCl4溶液(10 mmol/L)和400 μL菠萝蛋白酶溶液25 mg/mL(pH 8.0)，充分混合，室温孵育5 min；然后加入45 μL NaOH溶液(1 mol/L)，在恒温孵育仪中37 ℃、800 r/min继续孵育12 h，合成Bromelain-AuNCs。

1.3 Hg2+标准系列的紫外分光光度检测方法

在2 mL EP反应管中，依次加入pH=3.75，200 mmol/L 的NaAc-HAc缓冲液100 μL，Bro-AuNCs 25 μL，5 mmol/L TMB 30 μL，100 mmol/L H2O2110 μL以及不同浓度的Hg2+标准溶液，充分混匀后，于 37 ℃恒温混匀仪中反应 45 min。再加入 200 mmol/L H2SO4终止液 80 μL，用紫外-可见分光光度计比色测定，记录体系在450 nm波长处的吸光度值。

1.4 环境水样中Hg2+的测定

分别采集湘江水、池塘水、自来水环境水样，水样经定量滤纸过滤 3次后，置于电炉上加热煮沸持续15 min。静置冷却，使用0.22 μm微孔滤膜过滤，用1.3节的分析方法测定环境水样中的Hg2+。

2 结果与讨论

2.1 金纳米簇的表征

图1 体系紫外-可见吸收光谱和荧光光谱(A)和Bro-AuNCs 在5个月内的荧光稳定性(B)Fig.1 The UV-visible absorption and fluorescencespectra of the system of Bro-AuNCs(A) and thefluorescence stability of Bro-AuNCs within 5 months(B)

2.1.2 傅里叶变换红外光谱表征 傅里叶变换红外光谱测定结果见图2。

图2 菠萝蛋白酶和菠萝蛋白酶金纳米簇的傅里叶变换红外光谱图Fig.2 Fourier transform infrared spectrum ofbromelain and bromelain-AuNCs

由图2可知，1 600～1 700 cm-1为蛋白酶的酰胺Ⅰ谱带，其中1 629 cm-1为蛋白酶α螺旋部分的特征峰，由Bromelain稳定的金纳米簇在1 631 cm-1的特征峰有较为明显的增强，1 631.78 cm-1的特征峰位移到1 629.85 cm-1，1 000～1 200 cm-1的特征吸收峰消失，表明金纳米簇的形成主要和蛋白酶的α螺旋结构有关，蛋白质的二级结构发生了改变[9]。已有研究把酰氨Ⅰ带主要归属于C—O键伸缩振动及肽键的C—N伸缩振动。2 304 cm-1左右的 —SH特征吸收峰在金纳米簇中明显增强，表明了蛋白酶的 —SH与Au形成了Au—SH键。

2.1.3 TEM测试和XPS表征 本实验进一步用透射电子显微镜(TEM)测试表征了Bro-AuNCs的形貌和结构，由图3A表明，AuNCs呈球形，分布均匀，通过软件分析，AuNCs的粒径为0.9～2.8 nm，平均粒径(1.7±0.3)nm。X射线能量色散光谱(EDX)结果(图4A)表明，该物质主要元素为Au元素，与文献报道AuNCs的特征一致[10]。X射线光电子能谱(XPS)研究(图4B)表明，金的4f频谱被分成两个峰，结合能分别为84.02，84.77 eV，分别对应零价金和一价金，表明反应中生成了Au0和Au+，由金纳米簇的拟合数据可以看出，主要形成了Au0。

图3 TEM测试图和粒径分布图Fig.3 The TEM images and the picture size distribution figureA.Bro-AuNCs TEM；B.Bro-AuNCs粒径分布；C.Bro-AuNCs+Hg2+TEM；D.Bro-AuNCs+Hg2+粒径分布

图4 金纳米簇的X射线能量色散光谱图(A)和X 射线光电子能谱图(B)Fig.4 The EDX spectrum(A) and XPSspectrum(B) of Bro-AuNCs

2.2 实验原理

构建了一种汞抑制 Bro-AuNCs模拟过氧化物酶活性新型比色传感新方法，实验原理见图5。

图5 基于Bro-AuNCs-TMB-H2O2体系检测Hg2+示意图Fig.5 Schematic diagram of detection of Hg2+ ions based on Bro-AuNCs-TMB-H2O2 system

由图5可知，Bro-AuNCs具有较高的过氧化物酶活性，当体系中存在Hg2+时，由于AuNCs表面Au+与Hg2+之间的高亲和力金属亲和作用，Hg2+会增大AuNCs的粒径并使其发生团聚，大大降低AuNCs的催化能力，使Bro-AuNCs体系颜色从蓝色转变为无色。通过测定加入Hg2+后体系吸光度值的改变量(ΔA)，可以计算出汞离子的含量，在一定汞离子浓度范围内，ΔA值与汞离子浓度之间的定量关系为ΔA=Kc。据此，本文建立了基于Bro-AuNCs比色传感法定量测定Hg2+的新方法。

2.3 Hg2+抑制Bro-AuNCs介导的催化显色反应机制探讨

首先通过紫外-可见吸收光谱对加入 Hg2+后Bro-AuNCs的酶活性变化进行验证(图6A曲线a～f)。TMB溶液(曲线 a)和 H2O2-TMB溶液(曲线b)体系在450 nm 处都没有明显的吸收峰。在 Bro-AuNCs体系中，TMB-H2O2显色反应增强，A450显著增强(曲线f)，这表明本研究合成的Bro-AuNCs具有较高的过氧化物酶活性；当加入Hg2+后，Bro-AuNCs-Hg2+-TMB-H2O2体系的A450值显著降低(曲线e)。这一现象可能是由于Hg2+与Bro-AuNCs发生了相互作用后，Bro-AuNCs的过氧化物酶活性减弱，从而抑制TMB氧化显色。

进一步探讨了各体系在 60 min内的时间动力学曲线(图6B)，TMB-H2O2体系显色随时间增加而增强(曲线g)。当加入Bro-AuNCs后，A652吸光度值显著增强，表示Bro-AuNCs显示出较高的类过氧化物酶活性催化TMB 氧化显色(曲线i)。当加入 Bro-AuNCs和Hg2+后，0～3 000 s 内显色反应缓慢被抑制；3 000 s后，显著小于 TMB-H2O2体系(曲线h)。TEM测试结果(图3)表明，当体系中加入Hg2+后，Bro-AuNCs的平均粒径由原本的2 nm增大到7.5 nm左右。这进一步确证了由于AuNCs表面Hg2+和Au+之间的高亲和力金属亲和作用，Hg2+诱导AuNCs的粒径增大并使其团聚，抑制其过氧化物酶活性。

图6 不同体系中紫外吸收图谱(A)和体系中60 min内吸光度-时间曲线(B)Fig.6 The UV absorption spectrum mechanism ofdifferent systems(A) and absorbance-time curvein 60 min of the system(B)

2.4 共存物质影响

图7 不同金属离子对测定体系吸光度值的影响Fig.7 The effect of different interfering ions on the absorbance value of the measurement system

2.5 标准曲线、检出限与精密度

在优化后的实验条件下，配制Hg2+标准系列溶液进行定量分析实验，建立了测定Hg2+的标准曲线，见图8。

图8 Bro-AuNCs-TMB-H2O2-Hg2+传感系统的比色图、荧光光谱图和标准曲线图Fig.8 The visual observation(A)，fluorescencespectrum(B) and calibration curves(C) of theBro-AuNCs-TMB-H2O2-Hg2+ sensing system

由图8可知，当Hg2+浓度在 6.25×10-9～3.5×10-6mol/L时，A450的吸光度值随着Hg2+浓度的增加而逐渐降低，溶液颜色逐渐减弱，由蓝色转变为浅蓝色。此时，体系中吸光度差值ΔA与Hg2+浓度之间呈现良好的线性关系，回归方程为ΔA=0.000 7+0.191cHg(II)，相关系数r=0.996，经LOD=3Sb/k 计算，检出限为 4.3×10-3μmol/L。对汞离子浓度为0.2，1.75，3 μmol/L的三种标准溶液分别进行11次平行测定，相对标准偏差分别为0.65%，0.85%，3.0%，方法精密度良好。

2.6 环境水样分析

按照标准采样方法分别采集了5个不同来源的环境水样，对样品实施煮沸、过滤等预处理操作，按照测定Hg2+的方法分别测定 5 个环境水样中汞的含量。随后，采用真实样品中添加标准溶液的方法，对5个环境水样中分别添加浓度为0.375，1.75，3 μmol/L 的汞标准溶液进行加标回收实验，每个样品平行测定11次，结果见表1。

表1 环境水样中 Hg2+ 的加标回收率Table 1 Actual measurement and analysis of Hg2+ inenvironmental water samples

注：1.湘江水(上游)；2.湘江水(中游)；3.湘江水(下游)；4.池塘水；5.实验室自来水。

由表1可知，Hg2+的测定加标回收率为98.36%～103.95%，以上结果表明本方法可用于实际环境水样中Hg2+的检测，具有实际应用价值。

3 结论

制备了一种具有优良的荧光特性、较高的过氧化物酶活性的菠萝蛋白酶金纳米簇材料(Bro-AuNCs)，能够代替天然酶，有效提高了稳定性，可应用于生物传感领域。Hg2+能有效抑制Bro-AuNCs过氧化物酶活性，据此建立了高灵敏、高选择性测定环境水样中 Hg2+的比色传感平台。本文进一步探讨了Hg2+抑制Bro-AuNCs介导的催化显色反应机制，为新型蛋白质-金纳米簇的合成提供了新思路和新依据；拓宽了纳米材料模拟酶的应用。本方法操作简单、灵敏、检测效率高，有望在环境检测、生物医学、生物传感等领域广泛应用。