过氧化物酶体降解与疾病

牛 彦，郝梦格，姜玲玲，石 芸

(河北医科大学基础医学院生物化学与分子生物学研究室神经与血管教育部重点实验室，中国河北石家庄050017)

过氧化物酶体是存在于真核细胞中的一种具有单层膜结构的细胞器，因富含过氧化氢酶和多种过氧化物酶而得名，在脂肪酸氧化、磷脂合成和氧化应激等方面发挥重要作用[1]。过氧化物酶体的数量在不同细胞、不同生理和疾病状态下各不相同，表明过氧化物酶体在数量上存在异质性[2]，而探讨过氧化物酶体的这种异质性在研究微环境对细胞状态的影响方面具有重要作用。过氧化物酶体的数量由其生物发生[3]和降解两方面决定。哺乳动物过氧化物酶体的降解途径有3种:过氧化物酶体自噬、依赖LON多肽酶的过氧化物酶体降解和依赖12/15-脂氧合酶(12/15-lipoxygenase，12/15-LOX)的过氧化物酶体降解。本文就这些降解途径及其与疾病的关系进行综述，以期对过氧化物酶体的降解过程及其在疾病中的作用有更深的认识。

1 过氧化物酶体自噬

过氧化物酶体自噬是过氧化物酶体降解的主要形式[4]。虽然不同刺激因素引起的过氧化物酶体自噬的具体过程不尽相同，但目前较为确定的一个模式是，当各种因素导致过氧化物酶体自噬发生时，首先，过氧化物酶体膜上的某些蛋白质发生泛素化，随后泛素化的膜蛋白由NBR1(neighbor of BRCA1 gene 1)或p62或其他蛋白质介导与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3，LC3)结合，形成自噬小体，这些自噬小体进一步与溶酶体融合而被降解[5]。

过氧化物酶体膜上存在多种蛋白质，它们被称为过氧化物酶体膜蛋白(peroxisomal membrane protein，PMP)，其中，在过氧化物酶体生物发生中发挥重要作用的一类蛋白质被称为PEX(peroxin)。目前研究最透彻的是PEX5与过氧化物酶体自噬的关系。在过氧化物酶体生物发生过程中，PEX5负责过氧化物酶体基质蛋白向基质内的转运，但在氧化应激发生时，PEX5会将一个重要的蛋白激酶——毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白激酶(ataxia telangiectasia-mutated kinase，ATM)定位到过氧化物酶体膜上，从而开启过氧化物酶体自噬。研究发现，给予小鼠肝癌FAO细胞或人肝癌HepG2细胞过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)刺激后，细胞中的ATM激酶通过其氨基酸序列中的PEX5结合区与PEX5结合，进而定位到过氧化物酶体膜上而活化，活化的ATM随后磷酸化PEX5的S141位点，磷酸化的PEX5会使同样位于过氧化物酶体膜上的PEX2/10/12复合体发生构象改变，从而发挥出E3连接酶活性，泛素化PEX5的K209位点，泛素化的PEX5进而与p62结合，最终引发自噬[6]。将此过程中任何一个环节阻断，比如通过点突变分别抑制ATM到过氧化物酶体的定位、PEX5的磷酸化、PEX5的泛素化，再给予H2O2刺激，过氧化物酶体自噬均被抑制。除了外源给予H2O2外，利用干扰小RNA(small interfering RNA，siRNA)敲低或特异性抑制剂3-氨基三唑抑制过氧化氢酶的表达或活性也能增加细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平，促进过氧化物酶体自噬[7]。这些结果表明，氧化应激引起的过氧化物酶体自噬是ATM-PEX5依赖性的。有意思的是，PEX5的泛素化位点并不局限于K209，另一个位点C11的泛素化也由PEX2/10/12复合体催化，但C11泛素化的PEX5，会在同样位于过氧化物酶体膜上的AAA ATP酶复合体(ATPases associated with diverse cellular activities)的核心组分PEX1和PEX6形成的六聚体作用下，从过氧化物酶体膜上脱离，从而阻止过氧化物酶体的自噬[8]。所以，虽然由相同的泛素化酶催化，但催化的位点不一样，过氧化物酶体的结局也就不同。

除了氧化应激，氨基酸饥饿是另一个引起过氧化物酶体自噬的常见因素。用不含氨基酸的培养基培养人宫颈癌HeLa细胞24 h后，检测细胞的过氧化物酶体自噬情况，发现细胞中过氧化物酶体自噬被促进。进一步研究发现，这种由饥饿引起的自噬也需要PEX5的泛素化[9]。那么，此时PEX5的泛素化是否与氧化应激条件下一致，都是由PEX2/10/12复合体催化的呢？将HEK293-HAUb(HA-tagged ubiquitin)细胞中的 PEX2、PEX10和PEX12分别敲低，再给予不含氨基酸的培养基培养，检测细胞中PEX5的泛素化情况，发现只有PEX2敲低的细胞中没有检测到PEX5的泛素化，而敲低PEX10或PEX12并不影响PEX5的泛素化，表明正是 PEX2，而非PEX10或 PEX12，使PEX5发生了泛素化，这一点与氧化应激刺激下需要PEX2/10/12复合体来泛素化PEX5并不相同。除了PEX5，相同条件下，研究人员也检测到PMP70的泛素化改变，而且变化情况与PEX5一致。PMP70是过氧化物酶体膜上含量最高的膜蛋白，这一结果表明除了PEX5，PMP70也是PEX2这一E3连接酶的底物，而且泛素化的PMP70也参与氨基酸饥饿诱导的过氧化物酶体自噬[9]。除了泛素化，这些过氧化物酶体的膜蛋白还受到去泛素化调节。去泛素化也需要酶的催化，而泛素特异性肽酶30(ubiquitin specific peptidase 30，USP30)就是一个新近确认的能抑制过氧化物酶体自噬的去泛素化酶[10]。在HeLa细胞中过表达USP30，检测其亚细胞定位后发现，USP30与过氧化物酶体存在共定位，但是关于USP30是如何定位到过氧化物酶体的，目前还没有直接证据，推测可能与PEX16 或 PEX19 有关[11～12]。进一步的研究发现，过表达USP30后，原本由于氨基酸饥饿诱导的过氧化物酶体自噬被逆转，而突变的USP30却没有这种逆转能力，说明USP30确实能够抑制过氧化物酶体的自噬。既然USP30是去泛素化酶，那么，它的底物是否也是这些过氧化物酶体的膜蛋白呢？将HEK293-HA-Ub细胞中的USP30敲低，再给予不含氨基酸的培养基培养，检测细胞中PEX5、PMP70以及过氧化物酶体基质蛋白过氧化氢酶的泛素化情况，发现PEX5和PMP70的泛素化程度增加，而过氧化氢酶的泛素化程度没有明显改变[11]。PEX5和PMP70是泛素化酶PEX2的底物，这一结果表明USP30能够通过拮抗PEX2来调节过氧化物酶体的自噬情况，从而平衡细胞中过氧化物酶体的数量。

低氧也能诱导自噬。低氧条件下，脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)的活性受到抑制，使低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)不能被羟化，进而不能被泛素化酶VHL(von Hippel-Lindau)泛素化，导致HIF不能进入蛋白酶体降解而稳定存在于细胞中，因此，HIF常被认为是低氧的标志物[13]。利用VHL-/-基因敲除小鼠[14]或PHD抑制剂二甲基乙二酰基甘氨酸 (dimethyloxaloylglycine，DMOG)[15]稳定组织或细胞中HIF的水平来模拟低氧环境，再检测过氧化物酶体的自噬情况，发现过氧化物酶体的自噬均被促进，并且这种自噬是HIF-2α依赖性的。低氧在恶性肿瘤中广泛存在，既然低氧能促进过氧化物酶体自噬，那么，过氧化物酶体自噬是否与肿瘤的发生发展有关呢？研究发现，PEX2在肝癌组织中表达增加，而敲低PEX2的表达会显著抑制肝癌细胞的增殖；不出所料，敲低PEX10或PEX12也得到了相同的结果[16]。同样，敲低ATM的表达也能抑制结肠癌细胞的增殖，不仅如此，还能抑制其迁移和侵袭[17]。这些过氧化物酶体自噬相关分子在肿瘤中的表达变化，很可能意味着过氧化物酶体自噬在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。

过氧化物酶体生物发生缺陷病(peroxisome biogenesis disorder，PBD)是最为典型的与过氧化物酶体自噬异常有关的疾病。一直以来，人们都认为是参与过氧化物酶体生物发生的PEX基因突变，使过氧化物酶体的生物发生过程不能正常进行，导致成熟的过氧化物酶体缺失，从而引发PBD，但最近这种观点却有所改变，因为最常见的PBD的基因突变是发生在构成AAA ATP酶复合体的3个基因，即PEX1、PEX6和PEX26，突变占比分别为48.5%、13.1%和3.4%。如前所述，AAA ATP酶复合体能够使泛素化的PEX5从过氧化物酶体膜上脱离，从而阻止过氧化物酶体自噬的进程，进而使其保留下来，但突变的复合体就丧失了这种能力，过氧化物酶体会继续自噬的进程从而导致过氧化物酶体数量的减少[18]，所以，目前认为，至少65%的PBD都与过氧化物酶体的过度自噬有关[19]。如果真是这样，反而为PBD提供了一个新的治疗方向，即通过药物抑制过氧化物酶体自噬，以达到增加过氧化物酶体数量的目的。已有研究发现，以PEX1缺失(PEX1 null)或突变(PEX1-G843D)病人的成纤维细胞作为研究对象，分别给予3种不同的自噬抑制剂(LY294002、bafilomycin A1或chloroquine)刺激24 h，细胞中过氧化物酶体的数量均显著增加，其中，PEX1-G843D细胞中过氧化物酶体的数量甚至达到与野生型细胞中相似的程度[18]。因此，抑制过氧化物酶体的自噬有望成为新的PBD治疗靶点。

2 依赖LON多肽酶的过氧化物酶体降解

LONP2(Lon peptidase 2，peroxisomal)是过氧化物酶体特异的LON多肽酶，其主要功能是催化过氧化物酶体内部基质蛋白的降解[20]。正常情况下，LONP2会发挥类似分子伴侣的功能，协助蛋白质进行正确折叠；而当氧化应激、衰老等因素导致过氧化物酶体基质蛋白发生错误折叠或损伤时，LONP2会及时降解这些蛋白质，以保证过氧化物酶体的正常运行。但是，当错误折叠或受损的蛋白质过多，超过LONP2的降解能力时，过氧化物酶体就会发生自溶，由于这种过氧化物酶体降解的方式需要LONP2的参与，因此，称其为依赖LON多肽酶的过氧化物酶体降解。

目前，对于这个过程的很多细节尚不清楚，而有关其与疾病之间关系的研究更是少之又少。有学者将LONP2与存在于线粒体中的另一种LON多肽酶——LONP1进行了对比，发现二者在结构上有近40%的相似性，结构上的相似决定了功能上的相似，而目前发现，二者在蛋白质的水解以及对氧化应激的反应性上差别不大，又由于LONP1已被证实在衰老以及衰老相关疾病中对维持线粒体完整性起重要作用，因此，推测在结构和功能上与LONP1都相似的LONP2，也应该在这些疾病中发挥作用，但目前为止，尚没有这方面的报道[20]。不过值得注意的是，LONP2与癌症之间关系的研究已有所突破。研究发现，与正常组织相比，宫颈癌组织中LONP2的mRNA和蛋白质表达均明显增加；而敲低人宫颈癌SiHa和HeLa细胞中LONP2的表达水平能够抑制细胞的增殖、迁移和侵袭，同时降低ROS水平[21]。这些结果提示，LONP2促进宫颈癌的发生，可能是宫颈癌潜在的生物标志物和治疗靶点，但是LONP2如何促进宫颈癌的发生？是否与过氧化物酶体降解有关？还需要进一步的研究。

3 依赖12/15-LOX的过氧化物酶体降解

12/15-LOX是一种特殊的酶，它可以在无需磷脂酶的情况下，直接氧化含有多不饱和脂肪酸的脂膜，从而达到破坏细胞器，甚至细胞的目的。12/15-LOX和过氧化氢酶的双免疫荧光染色以及免疫电镜胶体金标记法都确认12/15-LOX定位到过氧化物酶体，而有活性的12/15-LOX能够破坏过氧化物酶体的膜结构，致使位于内部的基质蛋白(过氧化氢酶)外泄，说明12/15-LOX能够通过破坏过氧化物酶体的单层膜结构而导致过氧化物酶体降解[22]。12/15-LOX在糖尿病脑病[23]、中风[24]和阿尔茨海默病[25]等神经系统疾病中表达上调，利用12/15-LOX基因敲除小鼠或特异性抑制剂抑制12/15-LOX的活性，能相应减轻神经细胞的损伤[24～26]。在体内构建的Lewis肺癌小鼠模型中，12/15-LOX在内皮细胞中的特异性过表达能够促进癌细胞的死亡[27]。这些结果都提示，12/15-LOX的表达或活性异常与神经系统疾病和肿瘤的发生发展密切相关，因此，通过开发相应的药物来纠正这种异常很可能为这些疾病的治疗提供新的方向，但12/15-LOX引发这些疾病的具体机制以及过氧化物酶体降解在其中的作用，目前为止，尚不得而知。

4 总结与展望

综上所述，过氧化物酶体的降解与其生物发生过程一起，共同维持着细胞中过氧化物酶体数量的动态平衡。平衡一旦被打破，将会引发过氧化物酶体的功能紊乱，最终导致疾病的发生。目前，过氧化物酶体降解发生的具体过程尚有许多方面有待完善，比如:1)除了PEX5和PMP70，还有没有其他关键分子也是过氧化物酶体自噬的开关分子，这些分子一旦发生泛素化，就使得过氧化物酶体朝着自噬的方向发展；2)除了泛素化这种修饰，还有没有其他修饰方式也能诱导过氧化物酶体自噬；3)氧化应激、氨基酸饥饿、低氧等不同刺激方式均能诱导过氧化物酶体自噬，但这些“殊途”的刺激方式是如何共同诱导过氧化物酶体自噬而达到“同归”效果的，导致这种现象发生的关键节点到底是什么；4)为什么过氧化物酶体自噬在过氧化物酶体的降解中占主要地位，而依赖LON多肽酶和依赖12/15-LOX的过氧化物酶体降解的发生却相对较少。这些问题只是冰山一角，而随着这些问题的出现和不断被解答，我们对于过氧化物酶体的降解过程及其与疾病关系的认识将会愈加深入，最终有利于为这些疾病的预防和治疗提供新的思路。