miR-25、Aβ在认知功能障碍患者血清中表达的变化及临床意义

(焦作市人民医院神经内科，河南 焦作 454002)

进入21世纪以来，全球老龄化进程逐渐加快，导致阿尔茨海默病(AD)的发病率不断升高，如何应对AD已经成为我国重要的公共卫生安全和社会经济学问题之一[1]。目前关于AD的发病机制尚不明确，诊疗手段也不完善[2]，因此早诊断、早干预被认为是延缓疾病进程的关键。从已知的发生、发展机制分析，AD进程可以分为病理生理学阶段和临床阶段[3]。有研究认为早在AD患者出现临床症状前几十年，脑脊液中β淀粉样蛋白(Aβ)水平即出现降低趋势[4]。大脑和皮质海马区Aβ沉积形成老年斑是AD发生的早期病理学特征[5]，因此检测脑脊液中Aβ含量是早期诊断AD与其他神经退行性疾病的有效手段，甚至可以比正电子发射计算机断层现象(PET)更早检测出Aβ沉积[6]。但自脑脊液中提取Aβ并不方便，最新研究发现，可以通过结合免疫沉淀法以及质谱分析法检测血清中Aβ相关肽段水平来反映大脑中Aβ的沉积水平[7]。除此以外，微小核糖核酸(miRNAs)与AD的发生和发展也密切相关。有研究通过miRNAs基因芯片筛选后发现miR-25在AD患者大脑海马组织和循环血浆中均呈低表达，推测其与神经系统性疾病有关[8]。考虑到循环miRNAs具有高度的稳定性和特异性，分离、检测操作简单易行，因此本研究旨在探寻与Aβ沉积有关的miR-25在认知功能障碍(CI)患者血清中表达的变化，为AD患者临床诊断生物学标志物的筛选提供依据。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年5月—2019年3月我院确诊为CI的患者(CI组)98例，根据认知程度分为AD患者41例(AD组)，轻度CI(MCI)患者57例(MCI组)。其中AD组患者中男31例，女10例，年龄59～86岁，平均为(72.38±5.79)岁，均符合美国国立神经学、语言功能障碍和中风研究所规定的“疑似AD”的诊断的标准[9]，且通过简易智能精神状态检查量表(MMSE)[10]评分<最低阈值，Hachinski评分<4分。MCI组患者中男39例，女18例，年龄为61～87岁，平均为(73.68±5.94)岁，MMSE评分≥最低阈值，且≤26分，Hachinski评分<4分。所有的患者均排除帕金森病、血管性痴呆、恶性肿瘤以及心血管器质性疾病。另外选择同期在我院进行神经精神检查正常者50例作为对照组，并且排除患有恶性肿瘤以及心血管器质性病变者，对照组中男30例，女20例，年龄为60～85岁，平均为(73.65±6.10)岁，MMSE评分为27～30分。3组研究对象的年龄、性别、受教育年限、糖尿病史、高血压史、高脂血症史、吸烟史、饮酒史等基本资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象均知情同意，本研究已获得我院伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂和仪器

CFX-96-C1000 real-time PCR仪(美国Bio-Rad公司)；5810R型台式冷冻离心机以及移液器(德国Eppendorf公司)；EDTA-K2真空采血管(美国Becton Dickinson公司)。Aβ40以及Aβ42放射免疫分析试剂盒(天津九鼎医学生物工程公司)；血清miRNeasy快速提取分离试剂盒和逆转录试剂盒(日本Takara公司)；miScript SYBR Green PCR kit(德国Qiagen公司)。

1.3 研究方法

所有研究对象入组后24 h内采集空腹肘静脉血5 mL，室温静置2 h，3 500 r/min离心20 min，离心半径13.5 cm，取上清，置于-80 ℃保存备用。取血清样本，复溶后，采用血清miRNeasy提取试剂盒提取血清总RNAs，并检测其纯度和浓度。采用逆转录试剂盒将总RNAs逆转录成cDNA，并-20 ℃保存备用。配制25 μL实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)反应体系(12.5 μL SYBR Premix Taq+2 μL引物+2 μL模板+8.5 μL双蒸水)，反应条件为95 ℃预变性30 s；然后95 ℃变性5 s，58 ℃退火20 s，重复循环45次。收集荧光信号，每个反应体系的荧光信号到达所设定的阈值时所需要的循环数记为CT值，以小分子U6为内参照，采用2-△△CT计算miR-25相对表达量。miR-25引物序列：上游引物：5′-TGCGCTAGCACCATCTGAAAT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。小分子U6引物序列：上游引物：5′-TCCTCAGGTTGGCA-CAGGTG-3′，下游引物：5′-CACGTGTCGGTCAG-TCCTCA-3′。血清Aβ40和Aβ42水平检测严格遵循试剂盒说明书进行操作。记录所有受试对象血清中miR-25、Aβ40以及Aβ42水平，并计算Aβ42/Aβ40比值。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价miR-25、Aβ40、Aβ42、Aβ42/Aβ40对CI以及AD患者的诊断价值。同时记录所有研究对象的MMSE评分情况。

2 结 果

2.1 各组MMSE评分比较

对照组、MCI组和AD组患者MMSE评分分别为(28.42±0.93)、(22.35±2.64)和(14.66±5.05)分，差异具有统计学意义(F=212.847，P<0.05)；MCI组和AD组患者MMSE评分明显低于对照组，且以AD组患者MMSE评分最低，差异有显著性(q=14.000～29.179，P<0.05)。

2.2 各组血清中miR-25、Aβ水平比较

3组患者血清中miR-25水平、Aβ42水平、Aβ42/Aβ40比值比较，差异均具有显著意义(F=11.172～81.957，q=4.935～17.953，P<0.05)。见表1。

2.3 CI患者血清中miR-25、Aβ水平与MMSE评分的关系

CI患者血清中miR-25及Aβ42水平、Aβ42/Aβ40比值和MMSE评分呈正相关性(r=0.165～0.691，P<0.05)；而且患者血清中miR-25水平与Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值也均呈正相关性(r=0.184、0.339，P<0.05)。

2.4 血清中miR-25、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值对CI和AD患者的诊断价值

应用ROC曲线分析血清中miR-25以及联合Aβ42、Aβ42/Aβ40比值诊断CI和AD效能，结果显示miR-25+Aβ42+Aβ42/Aβ40对CI和AD诊断的灵敏度(84.34%、90.12%)和特异度(70.61%、84.13%)最高，而且诊断的效能最高(AUC分别为0.875、0.920)。见表2。

组别nmiR-25Aβ40(ρ/ng·L-1)Aβ42(ρ/ng·L-1)Aβ42/Aβ40对照组501.00±0.0742.41±12.3019.85±4.090.47±0.10MCI组570.85±0.0944.93±13.0217.47±3.140.39±0.09AD组410.73±0.1445.08±13.1516.52±3.260.35±0.06

表2 血清中miR-25、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值对CI和AD患者的诊断价值

指标组别AUC95%CI灵敏度(χ/%)特异度(χ/%)miR-25CI组0.8150.672～0.91880.7362.88AD组0.8870.765～0.95285.1965.42Aβ42CI组0.5360.379～0.69067.1370.82AD组0.3760.229～0.47350.1852.85Aβ42/Aβ40CI组0.6700.451～0.82472.1550.76AD组0.4780.307～0.68952.3055.68三者联合CI组0.8750.770～0.95684.3470.61AD组0.9200.879～0.99590.1284.13

3 讨 论

AD发病机制复杂，且病程长，临床上尚未出现有治愈可能的药物，只能以延缓疾病进展为主要治疗原则[11-13]。2018年，在AD协会国际会议上各国专家达成共识，认为未来AD临床治疗工作主要是提高对AD无症状期预防工作的重视，改变重治疗、轻预防的错误做法[14]。而早期诊断是AD患者早期干预的关键。同年，由首都医科大学宣武医院神经内科主任韩璎教授牵头成立了中国AD临床前期联盟[15]，该联盟成员以认知功能下降人群为研究突破口，以“寻找AD早期诊断生物学标志物”为主要工作内容，紧跟国际学术前沿，希望推动我国AD治疗的跨越式发展。

众所周知，大脑海马组织中胞外淀粉样斑块是AD主要的病变特征[16]。由淀粉样前体蛋白裂解生成的Aβ是老年斑的核心成分，可诱导神经元进行性损伤，逐渐引起患者CI和痴呆[17]。目前已知的脑组织中含量最丰富的Aβ是Aβ40以及Aβ42，尤其以Aβ42为最具药理活性的多肽片段[18]，早在上个世纪末就有学者证实脑脊液中Aβ蛋白是较为可靠的早期AD诊断的分子标志物。MOONIS等[19]认为患者脑脊液中Aβ42水平降低先于认知功能下降。MONDRAGN等[20]证实脑脊液中Aβ42水平变化可以反映纤维状Aβ蛋白的含量，从而间接反映老年斑聚集状态。但是脑脊液取材不便，属于侵入性操作，多数患者不易接受。最近日本学者通过结合免疫沉淀法和质谱分析法检测了循环血浆中大量Aβ片段，发现通过综合分析Aβ蛋白含量以及不同Aβ片段比例，可准确预测个体大脑中Aβ斑块沉积水平。和目前的技术相比，这些血浆生物标志物取材方便且操作简单，更经济，扩展性也更强，有望广泛应用于临床。JANELIDZE等[21]进行的一项大样本的研究分析发现，血浆中Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值在AD患者中降低。本研究结果也显示，与对照组相比较，MCI组和AD组患者血清中miR-25、Aβ42水平及Aβ42/Aβ40比值均降低，而且AD组患者血清中miR-25水平以及Aβ42/Aβ40比值降低更明显。但是经ROC曲线分析，Aβ42水平和Aβ42/Aβ40比值对于AD和CI患者的单独诊断效能较低，反而miR-25的诊断价值更高。考虑到本研究纳入的样本量偏少，不可避免会导致出现一定的假阳性结果，这也是本研究涉及的主要缺陷所在。但是无论如何，血清中miR-25在MCI和AD患者中确实表现出明显的表达差异，而且证实与患者的认知功能状态有关。

miRNAs是近年来全球医学界研究的热点[22]。但是其在AD方面的研究起步尚晚[23]。有学者通过miRNAs基因芯片技术筛查了AD患者或CI人群miRNAs表达谱，发现包括miR-25、miR-29b等多种基因呈异常低表达，推测大量miRNAs可能参与Aβ斑块沉积以及Tau蛋白磷酸化等过程[24]。SRKÖZY等[25]学者研究发现，miR-25通过靶向调控淀粉样前体蛋白基因的表达，进而参与AD的发病过程。DUAN等[26]也证实上调miR-25表达可抑制Aβ42沉积造成的大鼠海马组织神经元损伤。除了miR-25可直接结合APP 3′-端氨基酸序列或者APP相关的调控元件等外，miR-25可能还与Aβ产生的限速酶-β淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的表达有关。PIENIMAEKI等[27]研究显示，miR-25可抑制BACE1的表达，进而降低脑组织中Aβ水平。本研究结果也显示，MCI和AD患者的血清中miR-25水平明显低于对照组，而且AD患者血清中miR-25水平降低更明显。MMSE量表是国际上使用最普及的认知障碍筛查工具之一[28-30]。本研究结果显示，AD患者MMSE评分显著低于对照组和MCI组。通过相关性分析发现，血清中miR-25水平和MMSE评分、Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值呈正相关性，并且与Aβ42水平和Aβ42/Aβ40比值相比，miR-25单独诊断AD和MCI+AD患者的价值较高，说明miR-25、Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值都与CI患者的认知功能障碍存在一定的相关性。本项实验属于横断面研究，只是从临床角度证实miR-25与受试人群认知功能状态以及Aβ蛋白分子表达有关，尚未涉及到相关机制的研究。

综上所述，CI患者血清中miR-25、Aβ42水平以及Aβ42/Aβ40比值明显低于正常对照人群，而且随着CI的进展，该3项指标也逐渐降低。联合检测上述3项指标对于CI和AD具有良好的诊断效能。但是是否可作为临床现有诊断手段的辅助指标，尚需通过纵向研究明确miR-25和Aβ42在AD发生、发展中的作用机制，并进一步采取大样本研究丰富miR-25在CI患者中表达的循证数据，以证实本文结论的可靠性。