穿心莲内酯对人骨肉瘤细胞的影响及其分子机制

(1 青岛大学基础医学院特种医学系，山东 青岛 266071； 2 青岛大学附属医院放射科；3 青岛大学外科实验中心； 4 青岛大学医学部； 5 即墨市人民医院骨科)

骨肉瘤是一种恶性程度非常高的骨肿瘤[1]，多发于13～19岁的青少年，男性多于女性。临床主要以手术切除和放化疗等治疗为主[2-3]，放化疗副作用大，患者依从性差，影响患者预后。因此，寻找毒副作用小又有效的骨肉瘤治疗方法显得尤为重要。中药穿心莲具有清热燥湿、凉血解毒的功效[4-6]，临床广泛应用于治疗呼吸系统、泌尿系统、消化系统以及湿疹痈疮等病症[7-8]。穿心莲的主要成分穿心莲内酯(AG)具有抗肿瘤的活性[9-11]，对多种肿瘤均有疗效，研究发现AG能够通过抑制MMP-7活性从而降低人肺癌A549细胞的侵袭能力[12]；AG可以通过抑制PI3K/Akt信号通路引起人胶质瘤U251和U87细胞G2/M期阻滞，从而抑制人胶质母细胞瘤细胞的增殖能力[13]；AG还可以通过降低CXCL11、CXCR3和CXCR7的表达水平从而降低前列腺癌细胞的增殖和迁移能力[14]。然而，到目前为止关于AG对骨肉瘤细胞相关影响的研究报道较少。本研究通过探讨AG对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其分子机制,旨在为临床治疗骨肉瘤提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人骨肉瘤HOS和U2OS细胞系均由青岛大学基础医学院特种医学系提供。

1.2 仪器和试剂

RPMI-1640基础培养基、McCoy 5A基础培养基及细胞周期检测试剂盒均购自美国HyClone公司；AG购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell试剂盒购自美国Corning公司；BCA试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；山羊抗兔二抗购自安徽Biosharp公司；β-actin内参一抗购自上海雅酶生物科技有限公司；鞘氨醇激酶1(SphK1)兔单克隆一抗、黏着斑激酶(FAK)兔单克隆一抗购自杭州华安生物技术有限公司。孵箱、流式细胞仪(美国Thermo公司)；酶标仪(深圳雷杜生命科学股份公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；电泳仪、转膜仪(北京六一仪器厂)。

1.3 研究方法

1.3.1细胞培养及分组 人骨肉瘤HOS和U2OS细胞分别培养于含体积分数0.10胎牛血清的RPMI-1640基础培养基和McCoy 5A基础培养基中，置于37 ℃、含有体积分数0.05 CO2以及饱和湿度培养箱中培养。待细胞贴壁生长达到培养瓶底的80%～90%后，进行传代培养及其他实验操作。分别以含有AG为0、5、10、20、50、100 μmol/L(A、B、C、D、E、F组)的培养基培养人骨肉瘤细胞，每组设3个复孔。培养基培养24、48和72 h后分别于倒置显微镜下以细胞计数板计数各组细胞数量，并计算各组的细胞密度以及细胞生存率。细胞生存率=实验组细胞密度/A组细胞密度×100%；A组细胞生存率设置为100%。

1.3.2平板克隆实验观察细胞增殖能力 选取生长状态良好的人骨肉瘤HOS和U2OS细胞，以1.5×104个/孔的密度接种于24孔板中。过夜后，每孔分别加入1 mL含有0、5、10、20、50、100 μmol/L浓度AG(A、B、C、D、E、F组)的培养基。每组设3个复孔。培养1～2周后，弃培养基，甲醇固定后用体积分数为0.01的结晶紫染色液染色15 min。磷酸盐缓冲液(PBS)洗去浮色，风干后倒置显微镜下选取合适视野拍照，计数各组细胞集落数。

1.3.3Transwell小室实验观察细胞的侵袭和迁移能力 取生长状态良好的人骨肉瘤HOS和U2OS细胞以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，贴壁生长过夜后。以2 mL含有0 μmol/L(对照组)和合适浓度(实验组)的AG培养基对细胞进行预处理，依据细胞生存率和细胞集落数的实验结果选择合适的AG浓度，24 h后收集细胞，于Transwell小室加入500 μL含体积分数0.20胎牛血清的培养基，上室接种5×104个预处理后的细胞，铺基质胶(基质胶与无血清培养基为1∶9)100 μL检测人骨肉瘤细胞的侵袭能力，不铺基质胶检测人骨肉瘤细胞的迁移能力。每组设3个复孔。24 h后取出上室，弃培养基，棉签擦净上室未穿膜细胞，甲醇固定。以体积分数0.01结晶紫染色后，PBS洗去浮色，棉签再次擦净未穿膜细胞，风干，倒置显微镜下选取合适视野拍照，计数各组穿膜细胞数。对照组细胞的相对侵袭率及相对迁移率设为1.00，实验组的相对侵袭率及相对迁移率为实验组穿膜细胞数/对照组穿膜细胞数。

1.3.4流式细胞术观察细胞周期分布 取生长状态良好人骨肉瘤HOS和U2OS细胞，以1×106个/孔的密度接种于6孔板中，贴壁生长过夜以后，采用无血清培养基同步化以后再次过夜。每孔分别加入2 mL含有0、5、10、20、50、100 μmol/L浓度AG(A、B、C、D、E、F组)的培养基作用24 h。每组设3个复孔。收集细胞，冰预冷PBS清洗1次。离心去上清液，加1 mL PBS重悬。再次离心去上清液后，按细胞周期检测试剂盒说明书处理沉淀。流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.3.5Western Blot实验检测SphK1以及FAK的表达水平 将人骨肉瘤HOS和U2OS细胞用含0 μmol/L(对照组)和合适浓度AG(实验组)的培养基作用24 h，依据细胞生存率和细胞集落数的实验结果选择合适的AG浓度。RIPA裂解液分别提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。配好的蛋白胶凝固后加入等量样品，将电压调至80 V。待样品进入分离胶后，将电压调到120 V，直至溴酚蓝移动至分离胶底部。将目的蛋白胶转至PVDF膜后，加入含体积分数0.05脱脂奶粉的吐温20三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBST)室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜。吸净一抗，以TBST洗3次后，二抗室温孵育2 h，吸净二抗，TBST再次洗3次后，超敏发光液进行显影。实验重复3次，记录各组细胞SphK1以及FAK的表达水平。对照组的蛋白相对表达率设为1.00，实验组的蛋白相对表达率为实验组蛋白表达量/对照组蛋白表达量。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 AG对人骨肉瘤细胞生存率的影响

组别、时间以及组别与时间交互作用均对人骨肉瘤HOS以及U2OS细胞的生存率具有明显的影响(F组别=9 608.52、5 409.49，F时间=8 312.14、352.91，F时间*组别=18.06、3.55，P<0.05)。B～F组组内不同时间人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的生存率比较，差异具有显著性(F=47.06～5 098.89，P<0.05)；组间不同时间人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的生存率比较，差异均具有显著意义(F=815.81～5 624.93，P<0.05)。见表1、2。

组别24 h48 h72 hA组100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 B组87.35±1.2980.57±1.3074.15±1.14C组76.81±1.4268.62±1.5844.65±0.86D组67.43±0.6553.59±0.7629.47±0.81E组34.23±0.8827.06±0.4716.44±0.87F组33.65±0.4124.29±0.6314.40±0.55

组别24 h48 h72 hA组100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 B组95.81±1.2290.81±1.2588.75±1.32C组85.01±1.6481.14±2.0476.57±0.71D组77.96±2.3671.37±2.1169.33±1.27E组45.09±1.6841.00±1.6435.33±0.65F组45.29±0.6339.22±1.2133.89±0.61

2.2 AG对人骨肉瘤细胞增殖能力的影响

平板克隆实验的结果显示，A～F组人骨肉瘤HOS细胞的集落数分别为33.33±2.52、25.00±2.00、21.67±2.08、14.67±2.08、5.67±1.53、6.00±1.00，A～F组人骨肉瘤U2OS细胞的集落数分别为53.33±1.53、33.67±1.53、26.33±1.53、23.67±1.53、14.67±2.52、13.00±2.65。随着AG浓度的增高，人骨肉瘤HOS以及U2OS细胞的细胞集落数逐渐减少，差异具有统计学意义(FHOS=97.41，ts=4.44～17.56；FU2OS=174.13，ts=4.62～25.42，P<0.05)。见图1、2。

2.3 AG对人骨肉瘤细胞侵袭能力的影响

依据细胞生存率和细胞集落数的实验结果选择50 μmol/L为合适的AG浓度。Transwell实验结果显示，对照组和实验组HOS细胞的相对侵袭率分别为1.00±0.00和0.40±0.03，差异有统计学意义(t=39.06，P<0.05)；对照组以及实验组U2OS细胞的相对侵袭率则分别为1.00±0.00和0.24±0.02，差异有显著性(t=78.15，P<0.05)。见图3。

2.4 AG对人骨肉瘤细胞迁移能力的影响

依据细胞生存率和细胞集落数的实验结果选择50 μmol/L为合适的AG浓度。Transwell实验结果显示，对照组和实验组HOS细胞的相对迁移率分别为1.00±0.00和0.22±0.02，差异有统计学意义(t=83.74，P<0.05)；对照组和实验组U2OS细胞的相对迁移率分别为1.00±0.00和0.14±0.01，差异有统计学意义(t=135.96，P<0.05)。见图4。

2.5 AG对人骨肉瘤细胞细胞周期分布的影响

组别、周期及组别与周期交互作用均对人骨肉瘤HOS以及U2OS细胞的细胞周期分布具有明显影响(F组别=35.05、8.24，F周期=3 211.19、192.49，F周期*组别=75.96、140.97，P<0.05)。A～F组组内人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的周期分布比较，差异有显著性(F=22.07～1 472.60，P<0.05)；组间人骨肉瘤HOS和U2OS细胞的周期分布比较，差异有显著性(F=16.55～261.67，P<0.05)。见表3、4。

2.6 AG对SphK1和FAK表达水平的影响

依据细胞生存率和细胞集落数的实验结果选择50 μmol/L作为合适的AG浓度。Western Blot实验结果显示，对照组和试验组人骨肉瘤HOS细胞SphK1的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.81±0.02，FAK的相对表达水平分别为1.00±0.00以及0.14±0.02，差异均有统计学意义(t=15.94、75.22，P<0.05)；对照组和试验组人骨肉瘤U2OS细胞SphK1的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.83±0.02，FAK的相对表达水平分别为1.00±0.00和0.21±0.01，差异均有统计学意义(t=18.39、95.79，P<0.05)。见图5。

A～F分别为A～F组，4倍

A～F分别为A～F组，4倍

A～B分别为对照组和实验组人骨肉瘤HOS细胞的迁移能力；C～D分别为对照组和实验组人骨肉瘤U2OS细胞的迁移能力，10倍

组别G1期S期G2期A组35.90±0.3131.00±0.6725.93±0.56B组42.54±1.1730.21±0.6520.50±0.49C组40.96±0.5835.99±0.3917.63±0.70D组49.53±0.6725.81±0.9719.74±0.37E组47.62±0.7228.33±1.0018.18±0.77F组55.35±1.6929.82±1.1111.40±1.12

组别G1期S期G2期A组18.56±1.1647.17±1.1830.81±1.11B组34.53±0.8438.47±0.8926.69±1.62C组30.53±0.7338.65±0.9027.31±0.39D组39.14±1.2932.15±1.3927.09±1.00E组44.09±0.8928.38±0.3426.21±1.08F组36.32±0.5130.59±0.7232.52±1.05

图5 AG对人骨肉瘤细胞中SphK1和FAK表达水平的影响

3 讨 论

骨肉瘤是一种恶性程度很高的原发性骨肿瘤，具有恶性程度高、转移早、发展快、预后差的特点，临床主要的治疗方法有手术、化疗、放疗、基因疗法及免疫疗法等[15-17]。然而现阶段骨肉瘤临床治疗中仍然存在很多亟待解决的问题，如化疗后不良反应严重[18]、骨肉瘤对放疗的敏感性差、复发性和转移性骨肿瘤缺乏有效靶向治疗药物等[19]。因此寻找新的安全有效的骨肉瘤治疗方法尤为必要。

中药在临床中应用广泛而且效用独特[20-21]，很多中药具有良好的抗肿瘤活性，因而越来越受到人们的关注。穿心莲作为一种临床常用药物，除了具有传统的清热解毒、凉血、消肿、燥湿功效外，其主要成分AG还具有良好的抗肿瘤活性，对多种肿瘤治疗有效[22-23]。然而AG对骨肉瘤影响的研究较少，仅发现AG能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路和增强JNK信号通路来诱导人骨肉瘤细胞自噬，但对人骨肉瘤细胞的凋亡无明显影响[24]。

本研究首先以不同浓度AG分别处理人骨肉瘤HOS和U2OS细胞24、48、72 h，结果显示，与A组相比，各实验组人骨肉瘤细胞的生存率降低，并呈浓度和时间依赖性，提示AG对人骨肉瘤细胞具有杀伤作用；再进一步从AG对人骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移以及细胞周期分布的影响几个方面，探讨AG对人骨肉瘤细胞的作用机制。平板克隆实验结果显示，AG能够抑制人骨肉瘤细胞的增殖；Transwell实验结果表明，AG能够降低人骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力；流式细胞术结果表明，AG能够增加人骨肉瘤细胞G1期的构成比。

鞘脂代谢作为人体中一种重要的脂类代谢途径，在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等众多疾病的发生发展过程中可能发挥重要作用[25-28]，已成为近年来研究的新热点。SphK1是鞘脂代谢的重要调节酶。鞘脂在SphK1的作用下生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)，S1P作用于不同的S1P受体引起多种生物学效应。国内外大量研究表明，鞘脂代谢能够影响肿瘤的多种生物学性状，比如增殖、侵袭、迁移等，且在肿瘤细胞中SphK1过表达[25]，也有研究表明鞘脂代谢和骨肉瘤之间存在一定的关系[29-30]。但尚无AG对鞘脂代谢影响的相关报道。此外，近年来有研究表明SphK1能够通过影响FAK来影响肿瘤的侵袭和迁移能力[31]。本研究结果表明，与对照组相比，实验组SphK1以及FAK的表达水平下调，提示AG影响了鞘脂代谢，可能通过影响SphK1信号通路，影响人骨肉瘤细胞的生物学性状。

本研究较为全面地探究了AG对人骨肉瘤细胞的影响，结果表明其可能是骨肉瘤治疗潜在的药物，并且首次探讨了AG与鞘脂代谢的关系，初步表明AG可以影响SphK1信号通路，进而可能会由此影响到人骨肉瘤细胞的生物学性状，包括增殖、侵袭和迁移等，从而为骨肉瘤的治疗提供了新的理论依据。但AG对骨肉瘤的具体疗效还需要进一步研究确认，而且其对SphK1信号通路的具体影响机制也是下一步研究的重点。