循环肿瘤细胞、循环染色体异常细胞与肺癌早期诊断

(1 山东第一医科大学附属医院胸外科，山东 济南 250012； 2 山东大学附属山东省立医院呼吸与危重症医学科；3 珠海圣美生物诊断技术有限公司、粤港澳液态活检联合研究中心； 4 青岛大学附属医院小儿外科，山东省数字医学与计算机辅助手术重点实验室； 5 复旦大学附属中山医院呼吸与危重症医学科)

白春学教授，复旦大学附属中山医院主任医师、博士生和博士后导师，上海市领军人才，上海市呼吸内科临床质控中心主任，上海市“重中之重”临床重点学科呼吸内科负责人，上海市青浦云加端物联网医学中心实验室主任，国家卫生健康委员会临床重点专科呼吸内科负责人，上海市呼吸病研究所所长，复旦大学呼吸病研究所所长，复旦大学新农村研究院智慧医疗研究所所长，中国肺癌防治联盟主席，智惠大健康联盟创立主席，上海市控烟协会会长，中国非公医协会物联网医疗分会会长，亚太呼吸学会Treasuer主要领导人，ATS胸部肿瘤学委员和科委会委员，《Clinical e-Health》杂志主编。先后获国家自然科学基金重大、重点等48项科研课题。主编《现代呼吸病学》、《早期肺癌》和《物联网医学》等专著10部，获专利46项，牵头制定国内外呼吸病指南和共识22项，发表论著700余篇。

最新发布《全球疾病负担研究报告(The Global Burden of Disease study, GBD)》显示，2017年全球新发肿瘤患者约2 450万，其中发生于气管、支气管和肺(TBL)的肿瘤患者约220万，排在第2位[1-2]，2017年TBL肿瘤造成全球190万人死亡，占肿瘤死亡病例的23%[3]。需要注意的是，TBL在中国为癌症最高发器官，中国每年大约有78万肺癌新发患者，每5个恶性肿瘤死亡患者中大约有1个是肺癌患者[2]。

在肺癌早期阶段，患者一般无明显症状，目前由于缺乏早期诊断肺癌的有效方法，肺癌患者的早期确诊率只有约10%～15%[4]。若肺癌能在早期得到确诊，及时通过外科手术或非外科手段(如立体定向体部放射治疗)等进行干预，不仅增加了患者的长期生存机率，甚至有希望得到治愈。据统计，Ⅰ期肺癌患者在发现恶性结节后1个月内接受手术切除或其他治疗，其10年生存率可高达92%[4-5]。因此，早期诊断、早期治疗是提高肺癌患者生存率的关键。

美国国家肺癌筛查试验(NLST)的随机对照研究结果显示，与X线胸片相比，低剂量螺旋电子计算机断层扫描(LDCT)检查约可降低20%的肺癌死亡率，基于此项研究结果，LDCT被推荐可以用于高危人群的肺癌筛查[5]。但该研究同时发现LDCT检查的假阳性率可以高达96.4%[5]，为明确大量被LDCT筛查出患者的肺结节性质，临床上纤维支气管镜检、穿刺活检等侵入性、有创性临床诊疗操作明显增加，而在穿刺活检的肺结节中，约有1/3为良性[3]。同时，穿刺活检等可能对患者造成心理负担，并可能导致气胸、出血、肺功能受损等并发症[1-3，6]，使得临床亟需一种简便、安全、有效、无创的辅助诊断工具，并与影像学检查等协同评估肺结节的良恶性，从而优化与完善肺结节诊疗策略。随着液体活检技术的不断迭代发展，及其在临床上的不断应用，越来越显示出循环染色体异常细胞(CAC)、循环肿瘤细胞(CTC)技术在肺癌早期诊断中的重要性。本文拟对CAC、CTC在临床应用中的进展与挑战展开述评。

1 液体活检技术与CTC

组织活检作为肿瘤诊断的“金标准”，在临床实践中存在一定局限性，如体现在组织活检具有滞后性、部分患者因自身条件不适合组织活检、有创组织活检可加速肿瘤转移风险、已发生转移的肿瘤患者组织取样可能无法反映患者整体的情况等多个方面[7]。且肺癌是一种高度异质性的肿瘤，同一瘤体的不同位置，肿瘤细胞分化及其基因型均存在着差异[8]。当发生疾病进展、药物耐药或癌细胞转移时，肿瘤细胞的亚克隆不断变化，异质性情况更加多元化，组织活检难以完全覆盖临床需求[9]。而液体活检技术是一种通过血液、尿液、痰液、胸腹水、脑脊液等体液对疾病进行分析诊断的体外检测技术，与传统组织活检相比,液体活检具备无创性、可实时动态监测性、可克服肿瘤异质性、可提供全面的检测信息等的独特优势,能在一定程度上避免组织异质性对肿瘤分子分型的影响，被认为是未来极具潜力的肿瘤早期诊断技术之一，可以作为组织活检的有效补充手段。近十年来，液体活检技术发展迅速，已应用在临床肿瘤诊断以及治疗的各个阶段[10-12]。因此在肺癌疾病诊断领域，液体活检技术也是一种重要的诊断技术，主要包括自身抗体[13]、补体片段[14]、循环RNA[15]、循环肿瘤DNA[16-17]、CTC[18-19]、CAC[4]及外泌体[20]等各项指标的检测。各指标对肺癌的诊断效能见表1。

表1 不同指标对肺癌的诊断效能

其中，CTC的研究及其临床应用发展最为迅猛，CTC是指在实体肿瘤发生发展过程中，有少量细胞从原生肿瘤脱离进入血液，随血液循环到达新的定植器官，是肿瘤组织在外周血中最具有同源性的检测指标[23]。肿瘤原发灶或者转移灶内的肿瘤细胞通过主动迁移、侵袭或受外部因素影响导致脱落而进入循环血液中，这个转移过程中肿瘤细胞的存活需要适应微环境，伺机完成远端种植转移，而组织微环境对于CTC转移及生长至关重要，已经证实肿瘤早期阶段就可在患者淋巴结、外周血、骨髓等区域检测到CTC[24-27]。

脱落的肿瘤细胞，为能够进入循环系统并发生转移，会发生一些细胞生物特性的转变。基底膜等是阻止肿瘤细胞渗透和转移的物理屏障，因此肿瘤细胞必须克服这种障碍，通过上皮间质化(EMT)或非EMT介导的活性机制，调低上皮细胞黏附分子(EpCAM)表达等，获得穿透基底膜的能力进入循环系统，在到达转移器官毛细血管后，CTC会通过间质上皮转化(MET)等方式穿过血管上皮细胞，实现远端器官的转移[25-26，28]。

目前，CTC可以通过CELLSEARCH[29-31]以及ISET[32]等平台进行捕获和检测，其中阳性富集技术主要采用EpCAM与免疫磁珠相结合的方式来富集和分离CTC[11]。然而，这类技术同时受到CTC上EpCAM表达异质性的限制，因为大部分CTC从原发灶脱落或转移过程中都会发生EMT，失去了EpCAM表达，导致这类CTC无法被识别或者被捕获[32]。另一种阴性富集技术也称为白细胞去除法,用特异性抗体CD45、CD14等与白细胞结合，可在磁场作用下去除白细胞，从而使得CTC被沉淀和富集[11]。CHEN等[18]采用阴性富集技术在肺癌、肺部良性结节患者和健康受试者中进行CTC检测，其中肺癌或肺部良性结节患者中CTC阳性率大约为84.0%，而健康人中仅4.2%。同时多项研究也证实CTC与肿瘤原发灶之间的基因组具有一定的相似性[32-33]，提示可以在基因组层面对肿瘤细胞进行识别和检测。

2 CTC与肺癌早期诊断

虽然LDCT在肺癌早期筛查中发挥了重要作用，但受限于高假阳性率和肺结节鉴别诊断等问题，未能完全满足临床需求，而自身抗体、循环RNA等检测手段，也还未能对肺癌和肺结节良恶性进行独立与有效地诊断。研究发现CTC在肿瘤形成早期就存在于血液中，预示CTC在肺癌早期诊断方面可能是一个重要指标与突破口[34]。LLIE等[35]以肺癌高危人群为研究对象，纳入168例COPD患者为研究组，42例吸烟者和35例非吸烟者为对照组，所有入组者均经CT检查未发现肺部结节，外周血CTC检测发现，研究组中5例患者CTC阳性，而对照组中均未检出CTC；随后对研究组中CTC阳性与阴性的COPD患者每年进行LDCT随访，发现在4年随访过程中，CTC阳性的5例COPD患者CT检查陆续检出肺部结节，手术切除标本病理诊断为ⅠA期肺癌，在手术切除肺部肿瘤病灶随访1年后发现，CTC检测结果转为阴性，而CTC阴性的COPD患者均未发现肺部结节。这项研究很大程度上证实了CTC与肺结节、肺癌的相关性，CTC发现肺部病变可能会更早于影像学检查1～4年，具有肺癌早期诊断的临床价值。

在另一项早期肺癌的CTC研究中，18例Ⅰ期肺腺癌患者CTC检测诊断的灵敏度为94%，而在健康对照组中未检出CTC[36]，提示CTC对早期肿瘤有很高的诊断价值。CTC与其他诊断技术的相互补充，也有助于CTC检测对肺癌的早期诊断。在对80例Ⅰ期非小细胞肺癌患者和25例肺部良性病变患者进行CTC与PET-CT联合检测的研究中发现，与单纯依靠临床信息或PET-CT比较，CTC、临床信息及PET-CT三者相结合能显著提高肺癌的诊断效能，曲线下面积(AUC)由0.77提高至0.87，说明CTC联合临床信息或影像学技术，有助于肺癌的早期准确诊断[37]。

但是不同的CTC研究结果也显示出较大的差异，并且CTC数量与肺癌分期的关联性在不同研究中也存在争议，有研究认为CTC数量随临床分期进展而增多[38]，也有研究认为CTC在不同分期没有数量差异[39]，可能与研究样本量较小、平台不同或检测方法不同等有关，而目前还没有针对肺癌CTC的分离富集标准，所以寻找一种更加灵敏和准确的CTC检测方法，对其在肺癌早期诊断方面的临床应用十分重要。

3 CAC与肺癌早期诊断

通过CTC技术进行肺癌的早期诊断，必须要突破其对上皮细胞标记物(EpCAM等)的依赖，同时将CTC与血液中的白细胞区分开来[40]。2010年美国安德森癌症中心病理学教授KATZ等[41]在肺鳞状细胞癌和腺癌的外周血单个核细胞(PBMC)中发现多个共同缺失或扩增基因，开发出一种基于四色荧光原位杂交(FISH)技术来识别细胞基因组中3号染色体(3p22.1和3q29)与10号染色体(10q22.3和CEP10)的遗传学变化，并将这类具有相同染色体位点突变的PBMC命名为CAC，该研究结果还显示CAC可与LDCT联合辅助鉴别诊断良恶性肺结节，以提高诊断准确率，减少不必要的有创性病理组织检查。

2020年4月，KATZ等[4]又进一步公布了基于FISH的CAC检测技术的肺结节良恶性鉴别的临床研究成果，评估了CAC在肺结节患者外周血中的分布特征和辅助诊断价值。研究组纳入的107例肺癌受试者均来自美国安德森癌症中心，入组者满足以下条件:①近期无其他脏器肿瘤史；②经过针芯穿刺活检、细针抽吸活检、手术切除等确诊为肺癌患者。对照组纳入了100例基于年龄、吸烟史而定义为肺癌高危人群和自述无肺癌者，由以下3部分组成：①来自Kelsey-Seybold Clinics肺癌分子流行病学研究的受试者26例；②根据年龄、吸烟、肿瘤家族史划分为肺癌高危人群，并担心自己罹患肺癌(无肿瘤史)的受试者54例；③LDCT检查显示肺结节大于6 mm而穿刺活检病理学结果为良性的受试者20例。将2007年11月-2016年3月收集的118例患者定义为开发集，随后收集的89例患者定义为测试集。研究利用Ficoll-hypaque密度梯度离心法富集受试者外周血液样本中PBM，并使用4种不同颜色的FISH探针(3p22.1、3q29、10q22.3、CEP10)杂交PBMC(浓度调整为100μL中含40 000个PBMC)，对细胞染色体异常情况进行分析。研究结果显示，研究组肺癌患者的CAC中位数显著高于对照组。CAC计数≥3设定为cut off值，以确定阳性检测结果。通过与组织病理结果进行对照，开发集、测试集以及受试者整体的CAC诊断灵敏度分别为95.1%、80.0%和88.8%，特异度均为100%，开发集、测试集和受试者整体的CAC诊断准确率分别为97.5%、89.9%和94.2%，AUC分别为0.993 5、0.997 0和0.986 5，分析受试者随访数据发现，CAC数量与肿瘤复发和总体生存时间缩短之间存在正相关的关系。此外，在107例肺癌受试者中早期肺癌占61%，包括Ⅰ期55例、Ⅱ期10例，病理类型包括腺癌65例，鳞状细胞癌20例，其他癌种22例，验证了CAC检测技术能有效鉴别包括不同病理类型的早期肺癌与良性肺部结节性病变。

相关研究结果显示，基于FISH检测技术检出的CAC数量显著高于其他相似研究中报告的CTC的数量[4、12、30、42-46]，对血液中肿瘤特异稀有细胞检测具有较高的灵敏度。这种针对细胞染色体检测的技术是细胞病理学在临床运用中的一个重大突破，不仅可以作为传统组织病理检测的补充，还能用于其他非血液类样本的分析，如痰液、肺泡灌洗液等。在无创技术和取样简单背景下，CAC作为新的精准诊断指标，是细胞病理学领域又一充满希望的研究方向。同时，在中国临床试验注册中心(http://www.chictr.org.cn/)检索到一项正在进行中的，由复旦大学附属上海中山医院牵头发起的“BAI-DX & MDA TEST肺结节良恶性辅助诊断中国多中心临床研究”(ChiCTR1900026233)，计划入组1 400余例肺结节受试者，利用CAC检测技术与影像学人工智能(AI)分析技术相结合对肺结节良恶性进行诊断，这一前瞻性研究与其他研究不同，该研究入组人群限定在肺部结节<30 mm，排除了中晚期肺癌人群，符合辅助诊断技术在肺结节诊疗的临床应用场景。我们期待由CAC、影像学、肿瘤标记物、AI分析多种技术相结合建立的更精准的肺癌早期诊断工具与模型，以真正实现肺癌的早期诊断、早期治疗，从而处长病人生存期。

综上所述，由于肿瘤组织的难获取性，且往往不能多次获取，操作难度大和有创伤性等原因，液体活检有望成为肿瘤精准诊疗的重要组成部分，而CAC作为液体活检创新技术中一项新的指标，已在肺结节良恶性辅助诊断和肺癌早期诊断方面得到初步验证与应用。肿瘤早期发现、早期诊断和早期治疗是临床与科研人员重要的研究课题，随着CAC、物联网、影像AI分析、基因组学等技术的运用与整合，必将进一步推进临床真正实现肿瘤的早期诊断、早期治疗。