青地合剂对肺癌患者放射性肺损伤的保护作用及其机制

(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

肺癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤。放射治疗是治疗肺癌的主要手段之一[1-2]。虽然放射治疗可以杀死肿瘤细胞，但它也可以对正常组织造成损害。放射性肺损伤(RILI)是肺癌放疗中最常见的并发症，对靶区剂量提高及放疗的远期疗效均是重要的限制因素。虽然近些年来放射治疗设备不断更新，放射技术不断提高，但放疗引起的肺损伤发生率仍高达20.3%～36.9%[3-4]。目前预防性治疗RILI的基本手段是细胞保护剂的应用，其中应用较多的药物是阿米福汀，但其价格昂贵且副作用较大，难以广泛应用。因此，研制开发高效、低毒、价格低廉的放射防护剂具有广阔的前景。青地合剂由生地黄、麦冬、玄参、黄芩等成分组成，已经被证实在鼻咽癌和食管癌的放射治疗中，具有提高患者疗效和降低放疗毒性的作用[5-6]。临床经验性用药发现青地合剂对RILI的患者具有较好的治疗效果，但是目前尚无关于青地合剂在RILI中的作用及相关机制的研究报道。

多项研究表明，炎症反应在RILI的发生过程中起关键作用[7]，而超氧化物和羟基自由基等活性氧(ROS)是介导炎症反应引起正常器官放射性损伤的主要成分[8-9]。因此，清除体内的超氧化物和氧自由基及抑制组织内的炎症反应，可以有效降低放疗引起的副作用。研究发现，当机体超氧化物歧化酶(SOD)活性下降及丙二醛(MDA)含量增加时，提示体内氧化-抗氧化反应失去平衡，导致机体对照射的耐受性降低，从而增加受照射时的毒性作用[10-11]。通过对C57BL/6小鼠在给予9.5 Gy全身照射前注射MnSOD脂质体，发现使用MnSOD的小鼠较常规饮食小鼠其食管和肺组织的放射性损伤更轻[12]。KANG等[13]也检测到照射以后的小鼠肺组织中的MDA含量显著增加，进一步证实照射能引起肺组织内氧化应激反应。上述研究提示，抑制照射后组织的炎症反应及调节相关氧化应激产物的生成可以达到抑制放射性损伤的目的[7,13-14]。本研究通过观察青地合剂对临床患者相关症状的影响，并通过检测青地合剂对RILI小鼠肺组织中炎症反应、氧化应激指标(SOD、MDA)的调节情况，探讨青地合剂对RILI的作用及其机制，为青地合剂的临床应用提供依据。

1 资料和方法

1.1 临床资料和方法

对2016—2017年在我院肿瘤科接受胸部放射治疗的Ⅲ～Ⅳ期137例非小细胞肺癌患者的临床资料进行回顾性分析，其中放疗过程中使用青地合剂者71例(青地合剂组)，未使用青地合剂者66例(对照组)，比较两组患者RILI的发生率、发生时间、持续时间及被迫中断放疗例数和不同时间点最大自主通气量实测值占预计值的百分比(MVV实/预%)、一秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)等肺功能情况。依据《肿瘤放射治疗学》的RILI的临床诊断标准，经放射科医师根据其病史及影像学检查结果确诊为放射性肺损伤的时间认定为发生时间；对确诊后的RILI患者，经过持续治疗，参考国际抗癌联盟(UICC)的疗效判断标准评价RILI疗效，患者临床症状完全缓解或显著减轻、影像学检查中肺部炎症完全吸收或吸收50%以上，即达到治愈及显效的治疗期认定为RILI的持续时间。两组病人一般资料比较差异无显著性。见表1。

1.2 动物实验材料和方法

1.2.1实验动物分组及给药 10周龄C57BL/6雄鼠共45只(购自上海实验动物研究中心)，体质量约20 g，小鼠笼养于我院科教楼中心实验室，于实验前适应性饲养7 d，饲养期间饲料与饮水均不限制，自然光照，饲养温度为室温，湿度为55%～60%。随机分为空白对照组(A组)、单纯照射组(B组)及青地合剂组(C组)3组，每组各15只小鼠。青地合剂为我院自主开发的中药防辐射组合方剂，药品批号为2018101207，该方剂主要由生地黄、麦冬、玄参、黄芩、连翘、白芍、丹皮、党参和苜蓿组成。依据《中药药理研究方法学》的方法计算，根据成人临床用药量，按照小鼠的等效折算系数换算小鼠的给药量为0.02 mL/g体质量；放射处理后2 h灌胃给药一次，后每天1次连续给药4周，其中C组小鼠饲养期间每周称体质量一次，每周按体质量变化给予青地合剂(0.02 mL/g体质量)，A、B组给予等量生理盐水。

表1 两组病人一般资料比较

1.2.2照射前的准备及方法 用4%水合氯醛按0.01 mL/g体质量的剂量腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后放入自制鼠笼内，固定小鼠颈部及尾部使其仰卧于治疗床上，胸部充分暴露于射野内，铅板屏蔽其余部分，采用直线加速器用6MV-X线单次12 Gy照射小鼠全肺，0°单野照射，剂量率300 cGy/min，SSD为100 cm，根据小鼠大小及考虑相关误差的可能，照射野大小确定为3 cm×2 cm。

1.2.3标本取材及处理 于照射4周后用颈椎脱臼法处死所有小鼠，开胸取双侧肺组织，左肺留行组织学分析，右肺留行相关氧化应激指标的检测。

1.2.4组织病理检查及指标检测 将三组小鼠左肺组织分别置于甲醛溶液中固定24 h，常规进行脱水、浸蜡、包埋、切片等处理，采用常规HE染色，光镜下观察各组小鼠肺组织病理结构。采用羟胺法(NBT)和硫代巴比妥酸化学比色法分别测定小鼠右肺组织中SOD活性和MDA含量。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 两组临床观察指标比较

2.1.1两组RILI的发生情况比较 青地合剂组患者Ⅱ级以上放射性肺炎发生率为29.6%，对照组为36.4%，两组比较差异无显著性(P>0.05)。

2.1.2两组RILI的发生及持续时间等的比较 两组放射性肺炎发生时间、持续时间及被迫中断放疗例数比较，差异具有显著性(t=3.146、3.876,χ2=5.011，P<0.05)。见表2。

2.1.3两组肺功能变化比较 时间、组别及时间组别交互作用均对患者MVV实/预%具有显著影响(F时间=6.327，F组别=6.920，F时间*组别=6.548，P<0.05)；两组患者放疗前后不同时间MVV实/预%比较差异有显著性(F=8.241、6.014；P<0.05)；两组患者放疗后即刻、放疗后4周以及放疗后8周间MVV实/预%比较差异具有显著意义(F=5.479～7.389，P<0.05)。见表3。

时间、组别以及时间组别交互作用均对患者FEV1/FVC%具有显著影响(F时间=6.615，F组别=8.224，F时间*组别=7.124，P<0.05)；两组患者放疗前后不同时间FEV1/FVC%比较差异有显著性(F=9.251、8.018,P<0.05)；两组患者放疗后4周、放疗后8周间FEV1/FVC%比较差异具有显著性(F=5.834、7.014，P<0.05)。见表4。

组别发生时间(t/d)平均持续时间(t/d)被迫中断放疗情况(例(χ/%))对 照 组12.4±1.114.2±3.0 6.0(17.6)青地合剂组17.6±2.76.7±2.1 1.0(5.6)

组别放疗前放疗后即刻放疗后4周放疗后8周对 照 组81.1±4.470.9±4.872.2±3.874.3±2.5青地合剂组80.4±3.775.4±5.181.0±6.986.2±5.4

组别放疗前放疗后即刻放疗后4周放疗后8周对 照 组69.4±8.758.2±8.160.1±9.062.0±6.8青地合剂组68.8±8.260.1±9.064.9±7.669.9±8.4

2.2 各组小鼠实验观察指标比较

2.2.1各组小鼠肺组织中SOD活性及MDA含量比较 放疗后3组间小鼠肺组织中的SOD活性及MDA含量比较差异具有显著性(F=9.352、6.774,P<0.05)；B、C组小鼠肺组织中SOD活性低于A组(t=6.174、4.538,P<0.05)，而MDA含量均高于A组(t=4.327、3.121,P<0.05)；与B组比较，C组小鼠肺组织中的SOD活性明显增高(t=8.718,P<0.05),MDA含量明显降低(t=6.392，P<0.05)。见表5。

2.2.2各组小鼠肺组织病理组织学改变 A组小鼠肺组织肺泡壁纤细，毛细血管壁完整，无渗出和出血，结构清晰(图1A)；C组肺泡壁增厚，肺泡腔变小；肺泡壁内纤维细胞、巨噬细胞数量增多(图1B)；B组小鼠肺泡腔明显变小，肺间质内各种细胞成分增多(图1C)。

组别nSOD(z/kU·g-1)MDA(bB/μmol·g-1)A组1538.10±2.112.03±0.74B组1521.35±2.453.98±0.82C组1531.76±2.563.01±0.68

A、B、C分别为A、C、B组，HE染色，400倍

3 讨 论

RILI是胸部肿瘤放疗的常见并发症，不仅严重影响患者的生活质量，同时也限制了放疗的疗效及放疗技术的应用。传统放射防护剂(如氨磷汀、阿米福汀)大多具有生物利用度低、效价低和副作用多的缺点。天然中草药具有活性成分多、副作用少，价格低廉等优点，因此，寻找一种有效抑制RILI的中药方剂作为抗辐射药物具有重要意义。

青地合剂的多种成分具有扩张血管、改善循环、活血化瘀、促进炎症吸收、滋养肺肾等功效。既往研究证实青地合剂对放射性口腔炎及放射性食管炎均有较好的防护作用[5-6]。本研究中，青地合剂组患者相比对照组其Ⅱ级以上RILI的发生率相近，但应用青地合剂后，能延缓RILI的发生、发病时间更短、被迫中断放疗的例数更少；肺功能变化情况显示，放疗可导致患者的肺功能降低，随着放疗后时间的延长，肺功能可逐渐改善；放疗期间短期应用青地合剂，患者的肺功能恢复情况并不优于对照组，随着使用时间的增加，青地合剂组的肺功能恢复情况明显优于对照组。本研究结果证实应用青地合剂的患者RILI的发生时间晚，持续时间短，中断放疗例数少，肺功能恢复情况更好。

既往研究结果证实，放射治疗可引起组织炎症反应[15-17]，炎症反应的机制十分复杂，涉及一系列炎症因子的产生以及炎症细胞于放射治疗部位的聚集等[18]。相关研究显示，炎症因子的产生及炎症细胞的聚集是RILI早期的重要表现[19]；此外，炎症细胞是ROS的已知来源[20-21]，而ROS是介导炎症反应引起正常器官放射性损伤的主要成分[8-9]，炎性反应不断发展，后期将进展至肺纤维化期。因此，早期消除或减弱炎症反应，调节组织中的氧化应激水平，可以有效改善肺部炎症以及氧化反应，从而减轻RILI的严重程度，降低其后期纤维化的风险。FATTMAN等[14]的研究结果表明，敲除SOD基因的小鼠其肺组织中SOD分泌的丧失加重了肺部炎症和纤维化的程度；进一步研究提示，SOD抑制肺纤维化主要是通过抑制肺部的炎症反应而实现的。本研究采用12 Gy X线单次照射小鼠全肺，镜下观察显示放疗后小鼠肺泡上皮细胞增生，肺泡腔明显缩小，肺间质内炎症细胞明显增多，符合RILI早期炎症反应表现，C组小鼠肺组织中的上皮增生及炎症细胞浸润情况明显轻于B组，说明青地合剂可以减弱RILI的早期炎症反应，但其减弱RILI的炎症反应的具体分子机制目前还不清楚。此外，本实验结果还显示，C组小鼠肺组织中MDA含量明显低于B组，而SOD活性明显高于B组，提示青地合剂可通过有效调节小鼠肺组织中氧化应激水平，从而抑制RILI的炎症反应，达到促进RILI恢复的作用。

综上所述，青地合剂对RILI具有良好的防治作用，这种防治作用可能是通过抑制组织中的炎症反应及调节氧化应激产物表达(上调小鼠肺组织SOD活性及降低MDA水平)实现的，但其具体的分子调节机制还有待于进一步研究。