光照对硝酸甘油诱发的慢性偏头痛小鼠行为学症状的影响

蒲双双 令丽荷 丁 杰 符庆刚 杨旭娟△

1)兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000 2)甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 3)兰州大学第二临床医学院，甘肃 兰州 730030

偏头痛(migrane)是临床常见的原发性头痛，其特征是发作性、多为偏侧搏动性头痛，一般持续4～72 h，可伴有恶心、呕吐、眩晕、畏光等症状[1]。据流行病学数据显示，1/6的男性和1/5的女性有自述的严重头痛和偏头痛史，每年约占急诊就诊总数的3%[2]。在育龄妇女中，头痛是急诊就诊的第三大原因[3-4]。这是一种复杂的多因素、多基因影响的疾病[5-6]，与遗传、内分泌、饮食及精神因素等[7-9]均有一定关系，但其发病机制仍不完全清楚[10]。目前学说中血管学说主张偏头痛是由血管舒缩障碍引起的[11-12]，而经典造模方法中的硝酸甘油造模法也是通过影响血管的舒缩功能。也有学说认为皮质扩展性抑制(cortical spreading depressing，CSD)[13]及三叉神经血管学说中降钙素基因相关肽(calcitonin gene-realated peptide，CGRP)释放等有关[14]。弄清偏头痛的机制对患者的治疗和预后有十分重要的作用。

偏头痛的发作可由某些食物和药物诱发。食物包含腌制食物、奶制品、巧克力、辛辣食物、食品添加剂等，药物包括口服避孕药和血管扩张剂等，过劳和紧张情绪也是偏头痛的诱发因素。而灯光因素如亮光和频闪灯[15-17]作为一项易被人们忽视的因素，往往影响偏头痛疾病的转归。目前尚无光照影响偏头痛疾病进展的研究，故我们在此利用PRADHAN等[18]的硝酸甘油实验性慢性偏头痛造模方法[19-21]，利用亮灯和频闪灯来干预小鼠的生活环境，记录这些干预对小鼠的行为学影响[22-24]。以此探究合适的光照条件是否可以缓解患者的病程偏头痛。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物：雌性KM系健康小鼠，体质量(16±1)g，雌鼠25只，兰州大学实验动物中心提供。5只一笼饲养，分开进行实验，自然光照，通风良好，自由进食水。动物饲料：颗粒小鼠饲料，由兰州大学试验动物中心提供。

1.1.2 实验药物：硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)注射剂，0.9%生理盐水，30%乙醇，30%丙二醇。

1.1.3 实验装置：2 W LED灯光，40 W 108颗LED白光频闪灯(频闪速度1 s/次)。

1.2实验方法

1.2.1 分组及造模：随机分为空白组、造模(硝酸甘油，NTG)组、NTG-暗光组、NTG-亮光组、NTG-频闪光组，每组5只。空白组：小鼠腹腔注射生理盐水；造模组[18]：硝酸甘油制备液由5.0 mg·mL-1硝酸甘油、30%乙醇、30%丙二醇和水配制而成(4 ℃保存)，需要时0.9%氯化钠注射液稀释至10 mg·kg-1，间隔1 d小鼠腹腔注射稀释液，共9 d (5个测试日)，复制实验性慢性偏头痛模型，以注射后1～3 min出现双耳发红，前肢频繁挠头，爬笼次数增多等症状为造模成功的指标[25]。观察注射NTG 30 min内小鼠挠头和爬笼次数。NTG-暗光组：小鼠在完全避光条件下饲养；NTG-亮光组：小鼠在10 W的LED灯光下生活；NTG-频闪组：造模成功后，在环境处理室-暗室装置中间开一通道(频闪灯垂直照射，尽量使暗室无亮光)，15 min后计算小鼠进入暗室的概率。

1.2.2 观察内容和方法：(1)挠头、爬笼次数：记录造模30 min之后小鼠挠头和爬笼的次数。挠头开始时间以小鼠出现连续挠头次数>5次为标志。(2)体质量变化：每天同一时间测小鼠体质量。(3)位置偏好：计算NTG-暗光组和NTG-频闪组小鼠进入暗室的概率。

1.3统计学处理数据分析用SPSS软件处理，对小鼠挠头次数和爬笼次数进行重复测量的方差分析，对进入暗室小鼠比率进行独立样本t检验，以α=0.05为显著性水准。作图用GraphPad prism 6。

2 结果

2.1挠头空白组偶发有<1次挠头的症状(故不计)，造模后的大鼠在1～3 min后出现挠头症状，比较NTG-暗光组，NTG-亮光组和模型组挠头的次数，其中亮光组和模型组相比亮光组挠头次数显著上升(P<0.05)，且NTG亮光组和暗光组相比次数也显著上升(P<0.001)。见图1、表1。

2.2体质量变化在9 d的慢性偏头痛造模进程中，每天在同一时间对小鼠体质量进行测量，经过重复测量统计分析，发现对照组的体质量变化率和其他处理组相比有显著性差异(P<0.001)，而处理组之间的互相对比尚不能认为不同环境因素对小鼠的体质量变化有显著作用。见表2、图2。

2.3位置偏好[25]测试NTG暗光组和NTG频闪光组小鼠在测试日注入硝酸甘油注射剂后对于暗室和亮室的偏好，以进入暗室小鼠所占比率为衡量值，发现频闪光能显著增加小鼠的畏光(表现为闭眼，活动度下降，躲在角落)和避光(进入暗室)行为，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3、图3。

图1 小鼠在测试日挠头次数变化趋势Figure 1 Trends in the number of scratches on mice during the test day

图2 小鼠体质量增长率变化趋势Figure 2 The trend of growth rate of mouse body mass

表1 小鼠在测试日挠头的次数次数/30 min)Table 1 Number of times the mouse scratched the head on the test of times/30 min)

注：与NTG组比较，*P<0.05；与NTG-黑暗组比较，#P<0.05

表2 小鼠在9d内体质量增长率Table 2 Growth rate of body mass within 9

注：与NTG比较，*P<0.05

图3 频闪光和暗光处理条件下小鼠进入暗室的频率Figure 3 Frequency of mice entering the darkroom under stroboscopic and dim light conditions

3 讨论

偏头痛是一种常见的慢性神经血管性疾病，患病率为5%～10%。其治疗包括药物治疗和非药物治疗。药物治疗包含非甾体类抗炎药、麦角类制剂和曲普坦类药物，可分别缓解头痛、收缩脑血管，减少搏动幅度以及降低偏头痛时血中的CGRP含量。但不良反应包括胃溃疡、恶心、呕吐、心悸、焦虑等[26]。目前有研究表明CGRP受体拮抗剂是终止偏头痛急性发作的特异性药物[14]。非药物治疗包括健康生活方式，避免偏头痛的诱因和疾病加重因素。亮光和频闪光作为易被人们忽视的因素，往往影响慢性偏头痛疾病的转归。

本实验中，硝酸甘油注射后的小鼠出现了双耳发红，前肢频繁搔头，爬笼次数增多，说明偏头痛造模成功，且亮光和频闪光能加重小鼠的焦虑程度(挠头和爬笼次数表征)和诱导畏光行为(闭眼和缩进角落)。在造模的进程中(1～9 d)，小鼠的挠头次数下降，说明慢性偏头痛造模过程中，小鼠对硝酸甘油的耐受性增加[27]。本实验也说明慢性偏头痛会导致小鼠体质量下降，活动度下降。亮光、频闪光组和黑暗组的体质量与正常组相比均有显著差异，而不同灯光干预之间没有显著差异，说明偏头痛和小鼠体质量减轻有明显联系，而不同光照导致的差异较小。

本实验选择对偏头痛造模方法更敏感的雌性大鼠[28]，实验结果更典型。且选择了PRADHAN等[18]验证过的慢性偏头痛造模方法。此造模方法通过慢性和间歇给予硝酸甘油，引起小鼠足底机械性痛觉过敏[29]。有研究表明硝酸甘油通过诱导CGRP的基因表达，使脑膜血管舒张[14，30-31]。它简单、经济，可在短期内大量复制，且能够观察清醒状态下小鼠的行为学变化。但是此造模方法也有不足之处，它不能完全模拟偏头痛患者颅内血管变化[32]，且全身反应较大，运用行为学症状评价小鼠的对环境的影响不能做到客观公正。

亮光和频闪光能诱发偏头痛的发生而且能加重偏头痛患者头痛程度众所周知，但具体的分子机制还不清楚[33]，一些人认为，偏头痛发作时会激活从眼睛到大脑的特定神经通路，从而导致偏头痛患者暴露于亮光和频闪光后立即经历突然的光敏性和头痛症状[34]。黑暗环境可以缓解偏头痛症状，一项已发表的调查表明，超过90%的患者尝试过该方法，人们进入暗室10～20 min后症状开始缓解[35]。

本实验为光照影响偏头痛的机制提供了思路，若要证明光照和偏头痛的直接联系，还需要血清学和分子生物学的实验进行证明。除此之外，探究偏头痛患者是否对不同波长的光敏感性有差异也具有重要意义。

本实验探究了光照对于慢性偏头痛的影响，将环境因素对偏头痛的影响量化，能为人们的生活方式提供合理的建议，并且为弄清偏头痛发病机制提供依据。