液相色谱-串联质谱法测定焙烤食品中多种防腐剂含量

李青,蓝梦哲,宋光林,王大霞*,上官佳

1(广电计量检测(湖南)有限公司，湖南 长沙，410013) 2(广州广电计量检测股份有限公司，广东 广州，510335) 3(贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳，550002) 4(湖南省产商品质量监督检验研究院，湖南 长沙，410007)

防腐剂是指天然存在或合成的化学物质，能够有效地延迟微生物生长或化学变化引起的腐败，主要作用于食品、药品、颜料、生物标本等物质[1-6]。我国已批准32种可使用的食物防腐剂，最常用的有苯甲酸钠、山梨酸钾、脱氢乙酸[7-16]。各种防腐剂都有其自身不同的特点：苯甲酸钠的毒性较强，在相同的酸度值下抑菌效力仅为山梨酸钾的1/3，因此许多国家逐渐用山梨酸钾代替苯甲酸钠，但是它价格低廉，在碳酸饮料和果汁饮料中依旧被广泛使用；山梨酸钾抗菌力强，主要用于酱油、醋、饮料、糕点及面包；脱氢乙酸及钠盐类主要对霉菌及酵母菌有较强的抑制作用，在糕点中的应用较为广泛；对羟基苯甲酸酯类对细菌酶系有抑制作用，主要作用于水果饮料；纳他霉素对真菌有较强的破坏能力，可以高效地防止食物发霉，主要作用于果酱、饮料和香肠。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》(GB 2760—2016)规定，山梨酸、脱氢乙酸在糕点中的最大使用量分别为1.0、0.5 g/kg，糕点中纳他霉素的表面残留量不得超过10 mg/kg，苯甲酸、对羟基苯甲酸酯类不得在糕点、面包等焙烤食品中使用。

目前防腐剂检测方法主要有：气相色谱法[17-18]、液相色谱法[19-20]、液相色谱-串联质谱法[21-24]。前处理过程一般沿用萃取、离心、沉淀等经典方法[25-27]。本实验主要对焙烤食品中防腐剂残留量的检测进行研究，在进行蛋白沉淀和油脂去除处理后，通过HLB固相萃取柱对样液进行净化浓缩，提高检测精度，利用液相色谱的分离能力、质谱的高灵敏度，建立了一种可同时测定8种防腐剂的方法，既能满足各防腐剂的检出限和定量限要求，又能对各防腐剂混合使用量的计算提供便捷。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇、乙腈、无水乙醇，均为色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司；亚铁氰化钾、乙酸锌、乙酸铵，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

8种防腐剂标准品：苯甲酸、山梨酸、纳他霉素、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯，上海安谱实验科技股份有限公司。

在市内商场、小卖部、批发市场购买不同类型的面包、糕点、蛋糕、饼干、月饼、湘式挤压糕点样品，按照要求进行样品的制备。

1.2 仪器与设备

AB 4500液相色谱-质谱联用仪，美国AB Seiex公司；ME 204E电子天平，瑞士梅特勒公司；TTL-DCⅡ氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；AS30600BT超声振荡仪，天津奥特赛恩斯仪器公司；SBEQ-LG固相萃取仪，上海争巧科学仪器公司；H1850高速离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

分别取不同独立包装样品3个以上，用四分法进行样品分割，然后用粉碎机充分粉碎并搅拌均匀，粉碎效果不理想的样品用精制机进一步粉碎。取其中200 g密封于4 ℃冰箱保存待测。

准确称取2 g样品，加入10 mL正己烷后涡旋振荡1 min，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min后弃去正己烷，在残留物中加入2 mL乙醇、2 mL亚铁氰化钾溶液、2 mL乙酸锌溶液，涡旋混匀后加入15 mL超纯水，超声提取30 min，12 000 r/min离心3 min，转移上清液至25 mL容量瓶，加水定容至刻度。取5 mL样品溶液加至已用甲醇和水活化的HLB固相萃取柱上，用5 mL甲醇洗涤HLB柱，收集全部流出液，50 ℃氮吹至近干，加入1 mL体积分数50%甲醇水溶液溶解残留物，样液过0.22 μm滤膜，取500 μL进行液相色谱-串联质谱测定。

1.3.2 溶液的配制

亚铁氰化钾溶液0.25 mol/L：称取106 g亚铁氰化钾，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL。

乙酸锌溶液1.20 mol/L：称取220 g乙酸锌溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1 000 mL。

乙酸铵溶液(5 mmol/L)：称取0.385 g乙酸铵，加入适量水溶解，用水定容至1 000 mL，经0.22 μm水相微孔滤膜过滤后备用。

脱氢乙酸标准储备液：准确称取0.01 g脱氢乙酸标准品(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶，用NaOH溶液(0.02 mol/L)溶解并用水定容，配成1.00 mg/mL的标准储备液。

苯甲酸、山梨酸、纳他霉素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯标准储备液：分别称取0.01 g的苯甲酸、山梨酸、纳他霉素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯标准品(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容，配成1.00 mg/mL的标准储备液。

苯甲酸、山梨酸混合中间工作液(10.00 μg/mL)：分别移取0.1 mL的标准储备液于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容。

脱氢乙酸、纳他霉素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯混合中间工作液(1.00 μg/mL)：分别移取0.1 mL的标准储备液于100 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容。

混合标准工作液：分别移取不同体积的混合中间工作液于10 mL容量瓶，用基质空白溶液定容至刻度，配制成苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸为0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 μg/mL，纳他霉素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯为0.01、0.02、0.05、0.08、0.10 μg/mL的标准工作液。

1.3.3 液相色谱串联质谱方法的建立

1.3.3.1 液相色谱条件

色谱柱：C18(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；流动相A：5 mmoL/L乙酸铵溶液；流动相B：乙腈；流速0.2 mL/min；柱温35 ℃；进样量1.0 μL；流动相A的具体梯度洗脱条件：0～1 min，95%；1～3 min，95%～10%；3～6 min，10%；6～7 min，10%～95%；7～8 min，95%。

1.3.3.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(electrospray ionization)；扫描方式：多反应监测模式(multiple reaction monitoring)；气帘气压力(curtain pressure)：30.0 (1 psi=6.895 kPa)；离子化电压：正离子模式(ESI+)4 500 V，负离子模式(ESI-)-4 500 V；离子源温度：550.0 ℃；喷雾气：55.0 psi；辅助加热气：55.0 psi；Q1/Q3离子对、碰撞能量(collision energy)、去簇电压(uncluster voltage)及离子模式见表1。

表1 八种防腐剂的Q1/Q3离子对、碰撞能量、去簇电压及离子模式Table 1 Acids pairs, collision energy, declustering voltageand ion patterns of 8 preservatives

续表1

防腐剂母离子Q1子离子Q3去簇电压碰撞能离子模式对羟基苯甲酸丙酯179.0179.092.0∗136.0-50-50-33-20ESI-对羟基苯甲酸丁酯193.0193.092.0∗136.0-160-60-28-25ESI-

注：*表示定量离子

仪器条件确定后，配制不同浓度的标准溶液进行测定，根据化合物的仪器响应值，以3倍信噪比和10倍信噪比来确定物质的检出限和定量限。在检出限和定量限确定后配制不同梯度的标准溶液进行测定，根据线性关系拟合确定其线性范围。

1.3.4 线性范围、标准曲线、检出限及定量限的确定

选择月饼基质空白溶液配制各物质不同浓度的标准溶液，在稳定的仪器条件下测定其线性范围及标准曲线，以分析物峰面积对其浓度建立线性关系，通过回归方程Y=a+bX及线性关系(R2)确定各物质的线性范围，根据各物质线性范围及限值确定各物质的标准曲线浓度。以各物质标准曲线最低检测浓度进行加标实验，平行测定20次，按信噪比S/N=3计算检出限，按信噪比S/N=10计算定量限。

1.3.5 方法准确度实验

根据各物质的线性范围及其在面包、糕点、蛋糕、饼干、月饼、湘式挤压糕点样品中的最大允许使用量，以月饼为基质，选择高、中、低3个不同层次的浓度进行加标，每个浓度平行测定3次进行准确度实验，通过平均回收率和相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)来确定方法的准确度是否满足方法学的要求。

1.3.6 方法的实际应用

在确立了各物质的线性范围、检出限及定量限，并且方法准确度实验能够满足方法学要求后，在市内各商场、小卖部及批发市场随机购买数量不等的面包、糕点、蛋糕、饼干、月饼、湘式挤压糕点样品，对样品进行均匀地粉碎制备。按照所建立的检测方法进行前处理及仪器测定，对检测数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的确定

选择乙腈-乙酸铵、甲醇-乙酸铵的流动相两组组合进行比对，主要考察各目标物的分离度，同浓度下的响应值，在以乙腈-乙酸铵溶液为流动相时，各目标物的分离度比以甲醇-乙酸铵溶液为流动相时效果更好，最终选择乙腈-乙酸铵溶液作为本方法的流动相，具体数据如表2所示。

表2 同浓度下不同流动相相应值数据Table 2 Response data of different mobile phases at the same concentration

2.2 样品前处理优化

焙烤食品中蛋白质对防腐剂项目的检测具有较大的干扰作用。亚铁氰化钾和乙酸锌组合溶液是常用去蛋白试剂，在去除油脂和蛋白后选择HLB固相萃取柱进行净化操作，净化效果和回收率都能满足要求，糕点样品2.00 mg/kg浓度加标实验中，各物质的回收率在81.3%～97.4%之间。

2.3 线性范围、标准曲线、检出限及定量限

选择月饼基质空白溶液配制标准曲线，以分析物峰面积对其浓度建立线性关系，得到线性方程和线性范围，检出限按信噪比S/N=3，定量限按信噪比S/N=10计算。在0.02～2.00 mg/kg范围内纳他霉素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的线性关系良好，r2均在0.998以上，检出限为0.01 mg/kg，定量限为0.04 mg/kg。在0.1～50.00 mg/kg范围内苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的线性关系良好，r2均在0.998以上，检出限分别为0.1、0.05、0.01 mg/kg，定量限分别为0.4、0.2、0.04 mg/kg。

2.4 方法准确度实验

将8种防腐剂混合标准溶液以高、中、低3个水平分别添加到面包、糕点、蛋糕、饼干、月饼、湘式挤压糕点样品中，按照本实验前处理和仪器条件进行处理，验证方法的准确度。每个浓度平行测定3次，平均回收率在80.1%～101.2%之间，RSD在1.1%～6.7%之间(表3)。

表3 方法准确度实验数据(n=3)Table 3 Experimental data on method accuracy

续表3

化合物添加质量浓度/(mg·kg-1)回收率/%RSD/%脱氢乙酸0.183.10.589.22.081.44.1对羟基苯甲酸甲酯0.190.20.594.32.098.64.2对羟基苯甲酸乙酯0.191.50.589.32.090.61.1对羟基苯甲酸丙酯0.189.40.5101.22.089.86.7对羟基苯甲酸丁酯0.187.00.588.22.097.35.6

2.5 样品测定

从市场抽取112批次不同类型的样品，按照本文前处理分别对面包、糕点、蛋糕、饼干、月饼、湘式挤压糕点进行检测，其中湘式挤压糕点作为质控样，试验结果(表4)表明：在15批次月饼、10批次糕点、12批次湘式挤压糕点中有脱氢乙酸检出，15批次糕点、5批次湘式挤压糕点、15批次月饼中有山梨酸检出，3批次面包中有纳他霉素检出，对羟基苯甲酸酯类和苯甲酸在样品中均未检出。

3 结论

本研究通过液相色谱-串联质谱仪建立了同时测定焙烤食品中8种防腐剂的方法。样品经去除脂肪和蛋白质后进行HLB固相萃取柱的净化，氮吹浓缩后经液相色谱-质谱联用仪进行含量的测定。本方法可同时对苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、纳他霉素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的残留量进行检测，各物质在0.01～50 mg/kg的区间内有良好的线性，相关系数在0.998 67～0.999 84，检出限在0.01～0.1 mg/kg，定量限在0.04～0.4 mg/kg，相对标准偏差为1.1%～

表4 样品中防腐剂检出数Table 4 Number of samples detected with preservatives

注：“-”表示未检出

6.7%，均能满足方法学的要求，也能够满足《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》GB 2760—2016。本方法测定的8种物质均有防腐作用，对于监测项目防腐剂混合使用时各自用量占其最大使用量的比例之和的检测有着较大帮助，并且能够对不得使用的防腐剂进行确证和定量。