脂肪酶位置选择性及其应用在功能性结构甘油三酯合成中的研究进展

曹茜，王丹，袁永俊

(西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都，610039)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)可催化甘油三酯的水解，并根据水解程度的不同生成甘油二酯、甘油单酯、甘油和游离脂肪酸。大量的研究证实，脂肪酶不仅能催化水解反应，还能催化酯化、酸解、醇解和酯交换等合成反应[1-3]。食品中的脂质超过95%为甘油三酯[4]，因此脂肪酶在食用脂质领域应用广泛。与化学催化相比，脂肪酶催化的反应条件温和，因而能够节省能源；且该酶具有的各类选择性，使其副产物更少，产物纯化的压力也更小；此外，脂肪酶为蛋白质，具有生物可降解性，为环境友好型催化剂。由于上述原因，脂肪酶已成为应用最多的生物催化剂之一。

利用具有优良特性的脂肪酸替换原脂肪酸或者改变脂肪酸在甘油骨架上的位置可以改性甘油三酯结构，这些改性的脂质则被称为结构甘油三酯[5]。除了脂肪酸的组成，脂肪酸的位置分布也会影响甘油三酯的营养学价值和物理化学性质，因此位置选择性是脂肪酶各类选择性中最吸引食用脂质领域关注的特性，此选择性使脂肪酶在功能性结构甘油三酯的制备中具有难以取代的优势。本文从脂肪酶位置选择性的分类、分析方法、影响因素以及在功能性结构甘油三酯合成中的应用等方面对该特性进行综述。

1 脂肪酶位置选择性的分类

根据HIRSCHMANN提出的sn命名法，甘油骨架上碳原子自上而下编号为1～3，依据脂肪酶对特定位置是否具有催化能力，脂肪酶的位置选择性理应分为sn-1(3)位选择性、sn-2位选择性和无位置选择性：由表1可知，许多脂肪酶具有sn-1(3)位选择性，该类酶只会催化甘油酯的sn-1(3)位，sn-2位的脂肪酸组成会保持恒定；由于sn-2位与酶的活性中心结合的空间阻力较大，目前还没有发现只催化sn-2位的脂肪酶；一些脂肪酶已被证实无位置选择性(如表1所示)，即能够无差别地催化甘油酯的3个位置。

表1 不同脂肪酶的位置选择性Table 1 Regioselectivity of different lipases

注：1)随着反应溶剂lgP值(油水分配系数)的增长，其sn-1(3)位选择性减弱，详见3.1节

随着发现的脂肪酶增多以及分析方法的发展，脂肪酶的选择性已经很难简单地用此3类来划分，一些脂肪酶的性质介于sn-1(3)位选择性和无位置选择性之间，例如Mortierellaalliacea、Penicilliumabeanum、Penicilliumexpansum、Pseudomonassp. KB700A和Pseudomonasfluorescens所产脂肪酶催化sn-1或sn-3位的速率分别是sn-2位的2.2[6]、9[7]、9.3[8]、20[9]和35.8倍[10]；此外，虽然还没发现严格的sn-2位选择性脂肪酶，但Candidaantarctic脂肪酶A被发现具有sn-2位倾向性[11]，即该酶的性质介于sn-2位选择性和无位置选择性之间。

2 脂肪酶位置选择性的分析方法

2.1 薄层色谱法

最传统和最简便的检测脂肪酶位置选择性的方法是利用薄层色谱(thin layer chromatography，TLC)分离分析脂肪酶水解的甘油三酯产物来实现。脂肪酶的水解底物常选用三油酸甘油酯，将水解产物利用TLC分离后，显色观察(显色剂包括碘蒸气和2′,7′-二氯荧光素等)，若产物中的甘油二酯均为1,2(2,3)-甘油二酯，则该酶具有sn-1(3)位选择性，若同时含有1,2(2,3)-甘油二酯和1,3-甘油二酯，则该酶无位置选择性。利用TLC法，Aspergillusniger[12]、Aspergilluscarneus[13]、Anoxybacillusflavithermus[15]、Spirulinaplatensis[16]、Thermosyntrophalipolytica[17]、Geotrichummarinum[18]、Rhizopusoryzae[19]和Ralstoniasp. CS274[23]等所产脂肪酶被分析出具有sn-1(3)位选择性，Acinetobactercalcoaceticus[34]和Streptomycessp. CS268[37]等所产脂肪酶则被鉴定为无位置选择性。

普通TLC法主要用于定性，由于较难准确定量水解产物中1,2(2,3)-甘油二酯和1,3-甘油二酯的含量，无法获得两者的比例，因此不适宜分析具体位置选择倾向的脂肪酶，该类脂肪酶能催化所有位置，但会对某位置的速率更快。TLC联合火焰离子化检测器则可实现精准定量解决此问题，Penicilliumabeanum[7]、Pseudomonassp. KB700A[9]和Pseudomonasfluorescens[10]所产脂肪酶水解sn-1(3)位和sn-2位速率的差异便是通过此法来分析。此外，TLC薄层扫描仪也可用于定量，AKIL等[29]便利用此法分析了Yarrowialipolytica和Candidarugosa所产脂肪酶水解三油酸甘油酯的产物，理论上，若脂肪酶对3个位置的选择性相同，产物中1,2(2,3)-甘油二酯与1,3-甘油二酯的含量比值将会是2，根据分析结果，Yarrowialipolytica脂肪酶水解产物中该比值可超过50，因此该酶具较严格的sn-1(3)位选择性，而Candidarugosa脂肪酶的该比值为1.6～1.8，因而可认为该酶无位置选择性。

2.2 高效液相色谱法

脂肪酶水解甘油三酯产物中1,2(2,3)-甘油二酯与1,3-甘油二酯的比值也可利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)分析定量，常用的检测器为蒸发光散射检测器和电雾式检测器等。KOUTEU等[32]将葵花籽油、橄榄油、椰子油、花生油和棕榈油分别作为Adansoniagrandidieri和Jatrophamahafalensis种子中提取的脂肪酶的水解底物，反应结束后，利用HPLC分析产物中1,2(2,3)-甘油二酯与1,3-甘油二酯的比值，结果显示不同油脂作为催化底物时，两者的比值均很高，最高达到199，因此这2种酶具有严格的sn-1(3)位选择性。基于HPLC分析脂肪酶的水解产物这一方法，Rhizopusoryzae[20]和Rhizopuschinensis[38]所产脂肪酶的位置选择性也成功被鉴定，前者为sn-1(3)位选择性，与TLC法的结果一致，后者无选择性。从这2种酶的鉴定结果可以看出，即使是同属微生物所产的脂肪酶也可能具有不同的位置选择性。

CHANDLER[11]则建立了HPLC分析酸解反应产物来鉴定脂肪酶位置选择性的方法，反应底物为三油酸甘油酯和癸酸，一定时间间隔取样分析产物中甘油三酯的种类和含量，进而分别计算出sn-1(3)位和sn-2位的反应转化率并绘制出一阶对数曲线，各曲线的斜率除以酶的用量则反应了酶催化sn-1(3)位和sn-2位的酶活力，通过比较两者的差异便可确定酶的位置选择性。利用此方法，Rhizopusniveus脂肪酶被确定为严格sn-1(3)位选择性；Candidaantarctica脂肪酶A表现出sn-2位倾向性，其催化sn-2位的速率比sn-1(3)位快16%；2种Pseudomonassp.脂肪酶能催化3个位置，但sn-2位的速率仅为sn-1(3)位的20%。

2.3 气相色谱法

将甘油三酯上的脂肪酸甲酯化后再利用气相色谱(gas chromatography，GC)分析，则可获得甘油三酯的总脂肪酸组成；特异性水解甘油三酯sn-1和sn-3位上的脂肪酸生成2-甘油单酯后，再甲酯化单酯上的脂肪酸并通过GC测定，则可获得甘油三酯2位的脂肪酸组成；根据总的脂肪酸组成和sn-2位的脂肪酸组成，便可计算得到sn-1(3)位的脂肪酸组成。因此，GC可实现对甘油三酯的脂肪酸组成和位置分布的分析。基于此，便可利用GC测定脂肪酶的催化产物从而反映该酶的位置选择性。例如，以山茶油和月桂酸作为酶催化底物，利用GC分析该酸解反应的甘油三酯产物，根据sn-1(3)位月桂酸与sn-2位月桂酸含量的比值，Rhizomucormiehei、Aspergillusniger和Aspergillusoryzae所产脂肪酶被确定为严格sn-1(3)位选择性，Penicilliumexpansum脂肪酶催化sn-1(3)位的速率是sn-2位的9.3倍[8]。

2.4 13C核磁共振法

由于13C核磁共振(13C nuclear magnetic resonance，13C NMR)同样可以分析甘油二酯、甘油单酯等甘油三酯的水解产物，因此也可以用于脂肪酶位置选择性的分析。LI等[21]利用13C NMR分析了Rhizopusoryzae脂肪酶水解大豆油后得到的甘油二酯，依据1,3-甘油二酯的1,3-C和2-C对应峰分别是δ68.43和δ65.07 ppm以及1,2(2,3)-甘油二酯的1-C、2-C和3-C对应峰分别是δ61.99、δ72.13和δ61.58 ppm，分别分析2种甘油二酯，得到水解产物中1,3-甘油二酯含量极少，反映出该酶具有sn-1(3)位选择性。HE等[26]则依靠13C NMR分别分析了水解产物中1-甘油单酯和2-甘油单酯的含量，判断出Thermomyceslanuginosus脂肪酶具有sn-1(3)位选择性，原因是其水解产物中2-甘油单酯占绝对比例。

3 脂肪酶位置选择性的影响因素

3.1 反应介质

实际催化时，出于降低底物黏度或反应温度等目的，常常需要加入有机溶剂作为反应介质。许多研究都发现，脂肪酶在有机溶剂中的稳定性与该溶剂的lgP值(油水分配系数)密切相关，lgP值较高的有机溶剂有利于维持脂肪酶的活力[37]，因此己烷、庚烷、二氯甲烷等成为最常用的反应介质。大部分脂肪酶在不同有机溶剂中的位置选择性并没有显著差异，但Candidaantarctica脂肪酶B是个特例：DUAN等[33]研究了该酶与溶剂lgP的关系，结果表明，随着溶剂lgP值的增加，脂肪酶在反应介质中的sn-1(3)位选择性的严格程度会降低；WATANABE等[39]则研究了该酶与溶剂极性的关系，结果表明，随着溶剂的极性增高，该酶的sn-1(3)位选择性会增强；总之，Candidaantarctica脂肪酶B在醇类等溶剂(lgP值低、极性较高)中，表现出sn-1(3)位选择性，在正己烷等溶剂(lgP值高、无极性)中，表现出无位置选择性。

3.2 温度

温度对脂肪酶的位置选择性会产生显著影响。王子田等[40]在研究Lipozyme TLIM(Thermomyceslanuginosus脂肪酶固定在二氧化硅载体上的酶制剂)催化单油酸甘油酯与油酸合成1,3-二油酸甘油酯时发现，高反应温度会使酶的sn-1(3)位选择性降低，研究者认为这是由于sn-2位羟基与酶形成过度中间态所需的活化能要远高于sn-1(3)位羟基，因而前者在温度较低时很难实现，但随着温度升高，sn-2位的反应速度常数则增加更快。许多研究也发现，在利用脂肪酶选择性催化制备产物时，随着反应温度升高，目标产物的产率常常表现出先增加后减少[5,41]，也就是说最高温的产率往往低于次高温(温度均在酶的耐受范围内)，先增加是由于温度升高加快了反应速率，后减少便是因为酶的选择性降低，造成副产物增多。

3.3 底物的脂肪酸种类

前文提到的分析脂肪酶位置选择性的检测方法中，底物之所以常选用三油酸甘油酯等3个位置上均为相同脂肪酸的甘油三酯，就是为了避免底物的脂肪酸种类对位置选择性的影响，若脂肪酸位置分布不均匀，极端情况下，即使脂肪酶本身无位置选择性，但由于该酶不能水解存在于sn-2位的某类脂肪酸，则可能表现出假性sn-1(3)位选择性，或者该酶本具有sn-1(3)位倾向性，但由于sn-1(3)位上的脂肪酸不是其适宜的催化底物，使得检测结果偏向于无位置选择性。AKANBI等[42]在研究利用猪胰脂肪酶选择性富集鳀鱼油和海豹油中长链多不饱和脂肪酸时发现，尽管2种油中脂肪酸分布存在明显差异，二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)在鳀鱼油3个位置上含量较平均，但主要位于海豹油的sn-1(3)位，二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)主要分别位于鳀鱼油的sn-2位和海豹油的sn-1(3)位，而猪胰脂肪酶作为公认的sn-1(3)位选择性脂肪酶，在水解这2种油时竟得到相似的结果，即当水解度达到约50%时，DPA被大量水解富集到游离脂肪酸中，DHA则抵抗水解遗留下来并最终富集到甘油酯中。因此，在实际应用中，有时需要考虑到脂肪酶多种选择性共同作用的影响。

4 在功能性结构甘油三酯合成中的应用

4.1 制备类可可脂与可可脂改良剂

可可脂是可可豆中的天然脂肪，能赋予巧克力等食品独特的光泽感和入口即化的平滑感。可可脂特殊的熔融特性是由其甘油三酯构型决定，天然可可脂主要由棕榈酸(P)、硬脂酸(S)和油酸(O)构成，其中棕榈酸和硬脂酸主要位于sn-1(3)位，油酸主要位于sn-2位，最终形成17.6% POP(1,3-二棕榈酸-2-油酸甘油酯)、40.2% POS(1-棕榈酸-2-油酸-3-硬脂酸甘油酯)和25.7% SOS(1,3-二硬脂酸-2-油酸甘油酯)的甘油三酯构型[43]。天然可可脂价格高且产量有限，难以满足日益增长的需求，因而出现类可可脂，即人工合成、物理融化性质和甘油三酯构型与可可脂接近、具有可可脂口感且价格较低的可可脂替代品[44]。为了模拟可可脂的甘油三酯构型，常需sn-1(3)位选择性脂肪酶的参与。BAHARI等[43]利用Lipozyme RM IM(Rhizomucormiehei脂肪酶固定在阳离子交换树脂上的酶制剂)催化雾冰草脂与棕榈油中熔点物在sn-1(3)位上的酯交换反应来制备类可可脂，所得产物的甘油三酯组成与天然可可脂十分接近，含有18.3% POP、41.6% POS和29.8% SOS；且由该类可可脂制得的黑巧克力和白巧克力在粒径分布、质地和流变学性质等方面均与天然可可脂制备的同种巧克力没有显著差异[45]。

虽然可可脂是生产巧克力的理想脂质，但其受热易变软的特性使其在热带地区的应用受限。此外，若巧克力制备时回火不当或者保存不当，则会出现反霜，即巧克力表面不良的白色灰尘样析出，导致巧克力品质降低。SOS可作为可可脂的改良剂和抗白霜剂，应用到巧克力的工业生产中。WANG等[46]分别将3种sn-1(3)位选择性脂肪酶，即Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM和NS40086(Aspergillusoryzae脂肪酶固定在聚丙烯酸树脂上的酶制剂)，用于催化高油酸葵花籽油与硬脂酸的酸解反应制备SOS，结果表明在该反应中NS40086的催化效率最高。

4.2 制备人母乳脂肪替代品

独特的OPO(1,3-二油酸-2-棕榈酸甘油酯)存在于天然人母乳脂中，该结构甘油三酯对于婴幼儿钙和脂质的吸收至关重要。人类的胰脂肪酶因为具有sn-1(3)位选择性，会特异性地水解人母乳脂sn-1(3)位上以油酸为主的不饱和脂肪酸，生成2-单棕榈酸甘油酯，棕榈酸以甘油单酯形式存在时易被吸收，不会与钙离子等生成不溶性皂钙，从而避免婴儿便秘和消化不良[47]。目前，不少母亲因健康、经济、时间和宗教等原因，无法哺育孩子，因此婴幼儿配方奶粉一直具有广阔的市场前景，而人母乳脂肪替代品是婴幼儿配方奶粉不可或缺的成分。但OPO并不是其他哺乳动物乳脂以及植物油脂的主要组成[48]，所以难以利用其他乳脂和植物油直接调配人母乳脂肪替代品。

利用脂肪酶催化合成富含OPO的甘油三酯作为人母乳脂肪替代品，不仅温和而且高效，已成为最常使用的制备方法。该方法第1步需要获得sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯，由于还未发现sn-2位专一性脂肪酶，这一步可由无位置选择性脂肪酶实现。JIMÉNEZ等[49]以Novozym 435(Candidaantarctica脂肪酶B固定在聚丙烯酸树脂上的酶制剂)作为生物催化剂催化棕榈硬脂与棕榈酸的酸解反应，成功制备sn-2位富含棕榈酸的甘油三酯。第2步则需要sn-1(3)位选择性脂肪酶，将以油酸为主的不饱和脂肪酸结合到第1步产物的sn-1(3)位上，文献中常用于此步的催化剂有Rhizopusoryzae脂肪酶[47]、Lipozyme TL IM[1,4]和Lipozyme RM IM[1,4,50]等。

4.3 制备MLM型结构酯

Sn-1(3)位为中链(medium-chain，M)脂肪酸、sn-2位为长链(long-chain，L)脂肪酸的甘油三酯被称为MLM型结构酯。许多研究证实ω3 长链多不饱和脂肪酸能够降低人体炎症、心脑血管疾病、肿瘤和神经失调等的风险[51]，例如，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)是前列腺素、血栓素和白细胞三烯的前体，这些均是有效的抗聚合物质，DHA是大脑和视网膜的细胞膜磷脂的组成成分，与婴幼儿的大脑发育和老人的退行性疾病密切相关。此外，亚油酸(一种ω6长链多不饱和脂肪酸)是人体的必需脂肪酸之一。因此，MLM型结构酯中的L通常特指长链多不饱和脂肪酸。在人体消化过程中，胰脂肪酶会专一性地水解下MLM型结构酯sn-1(3)位的中链脂肪酸，该类脂肪酸会优先通过门静脉进入肝脏进行代谢，并且其代谢速度与葡萄糖相当，能够快速供能[5]；此外，由于这些脂肪酸很难再重新酯化形成新的甘油三酯，因此不会以脂肪的形式储存起来，具有控制体重的功能[52]。与此同时，另一水解产物——富含长链多不饱和脂肪酸的2-甘油单酯，则通过淋巴途径被很好地吸收。MLM型结构酯的合成也需要具有精密位置选择性的脂肪酶作为催化剂，一般包括3种合成途径：

第1种途径是利用富含长链多不饱和脂肪酸的天然油脂作为底物，与中链脂肪酸在sn-1(3)位选择性脂肪酶的催化下发生酸解反应直接制备。COSTA等[5]基于葡萄籽油的sn-2位富含亚油酸的特性，利用具有sn-1(3)位选择性的Rhizopusoryzae脂肪酶和Caricapapaya脂肪酶分别催化该油与辛酸或癸酸的酸解反应，制备MLM型结构酯，产率可达69%。第2种合成途径分2步，第1步合成富含长链多不饱和脂肪酸的甘油三酯，第2步则与第1种途径相同，通过酸解反应完成制备。KAWASHIMA等[53]在制备时便采用了这一途径，首先利用Novozym 435的无位置选择性分别制备亚麻酸、花生四烯酸、EPA和DHA的甘油三酯，含量分别可达89%、89%、88%和83%，接着分别在Rhizopusdelemar脂肪酶的催化下完成sn-1(3)位与辛酸的酸解反应，实现MLM型结构酯的制备。第3种合成途径也需2步，第1步醇解制备长链多不饱和脂肪酸的2-甘油单酯，第2步以2-甘油单酯与中链脂肪酸为底物制备MLM型结构酯。RODRGUEZ等[54]便利用这一途径实现了制备，首先利用鱼肝油与乙醇在Novozym 435催化下醇解制备富含长链多不饱和脂肪酸的2-甘油单酯，3.1节中已说明Novozym 435(酶为Candidaantarctica脂肪酶B)在醇类中表现出sn-1(3)位选择性，所以适宜用于第1步反应，然后将制得的2-甘油单酯与辛酸在Rhizopusoryzae脂肪酶的催化下，利用该酶的sn-1(3)位选择性，通过酯化反应完成MLM型结构酯的制备。

5 总结与展望

目前，国内外对健康相关领域的关注度持续增加，因此功能性结构甘油三酯的需求日趋增大，这些脂质正在不断丰富与改进人类的普通食品和功能性食品，而脂肪酶的位置选择性对于功能性结构甘油三酯的制备具有不可取代的优势。现有研究中，位置选择性的鉴定分析方法已较为成熟，关于位置选择性影响因素的研究成果也较为丰富，这些均为该特性的顺利应用奠定了重要基础。

脂肪酶位置选择性的实际应用中，常常会涉及到甘油酯的酰基迁移作用。酰基迁移起初是在严格sn-1(3)位选择性酶催化时受到关注，为了提高目标产物的产率，需要优化反应条件从而最小化酰基迁移对酶选择性催化的影响。随着相关研究增多，人们发现酰基迁移也是可以利用的手段，例如无位置选择性酶催化合成人造黄油时，促进酰基迁移则有利于脂肪酸的快速随机化，达到缩短制备时间的目的。事实上，除了严格选择性和完全随机化2种极端情况外，要实现精准模拟天然功能性脂质则常常需要介于两者之间的催化能力，若能深入研究脂肪酶位置选择性和酰基迁移的协同作用，结构甘油三酯的自由定制则变为可能，这将是脂肪酶位置选择性未来的重要研究方向。