通过敲除解淀粉芽胞杆菌表面活性剂基因促进S-腺苷甲硫氨酸合成

姜聪，郭爱玲，魏雪团

(华中农业大学 食品科学技术学院，湖北 武汉，430070)

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)，是生物体内含硫氨基酸代谢的一个关键组成部分，由甲硫氨酸和三磷酸腺苷通过蛋氨酸腺苷转移酶合成[1]。SAM在细胞中主要参与转甲基化[2]、转硫化[3]和脂肪多胺合成[4]，被视为生物体中的关键代谢物，常用于预防和改善肝病、关节炎、抑郁症、阿尔茨海默氏症等多种疾病[5-7]。欧美国家已将其批准用作膳食补充剂[8]。因此，开发SAM相关产品具有重要的意义。

微生物发酵法是生产SAM的主要方法。早期的研究普遍通过添加大量甲硫氨酸前体物来实现SAM的高效合成，产量可达10 g/L以上[9]，但甲硫氨酸添加量大、成本高，且转化率低，导致SAM价格昂贵[10]。进而有研究者以廉价糖类碳源从头合成SAM，以期降低发酵成本[11]。然而，目前从头合成SAM的产量仍较低，尚需开展深入研究。课题组前期通过解淀粉芽胞杆菌从头合成SAM，通过途径耦合代谢工程策略强化了SAM的合成[12]，该法在SAM的从头合成中具有重要的应用潜力，但仍需开展大量研究工作。

解淀粉芽胞杆菌可大量合成两亲性脂肽类表面活性剂副产物[13]，不仅消耗大量的能量，而且这些表面活性剂可导致发酵过程起泡严重，影响发酵过程[14]。芽胞杆菌产生的脂肽类表面活性剂主要包括iturin和surfactin，其中iturin主要由ituDABC操纵子基因编码[15-16]，surfactin主要由srfA-ABCD操纵子基因编码[17-18]。通过基因敲除技术阻断iturin和surfactin的合成有望促进SAM的合成，然而目前还未见相关报道。因此，本研究通过基因敲除技术敲除解淀粉芽孢杆菌中的ituD和SrfAC基因，阻断iturin和surfactin的合成，以期降低发酵过程脂肽类副产物和发酵泡沫，以期提高SAM产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

本研究所用到的菌株和质粒如表1和表2所示。其中大肠杆菌DH5α用于构建载体。

表1 实验用菌株Table 1 Strains used in this study

表2 实验用质粒Table 2 Plasmids used in this study

注：Tetr：四环素抗性；Kanr：卡那霉素抗性；orits：温敏型复制子

1.1.2 PCR引物

本研究所用的主要引物见表3。

表3 本研究所使用的PCR引物Table 3 Primers used for PCR in this study

注：粗体为限制性内切酶酶切位点，划线为重叠延伸PCR (SOE-PCR)的重叠区域

1.1.3 主要培养基

SAM发酵培养基(g/L):蔗糖80，蛋白胨10，玉米浆5，天冬氨酸3，尿素2，NaCl 2.5，(NH4)2SO46.3，KH2PO43，MgSO4·7H2O 4.2，pH 6.5。

LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸出粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.2，固体培养基加琼脂1.5%。

1.1.4 工具酶和试剂

DNA抽提试剂盒,武汉楚诚正茂科技工程有限公司；TransStartR FastPfuDNA聚合酶和TransStartR easyTaqDNA聚合酶,北京全式金公司；DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶，DNA回收试剂盒和质粒抽提试剂盒，美国OmegaBio-Tek公司；DL5000 Marker，TaKaRa公司；琼脂糖，Spanish公司；Kan、Tet、溶菌酶、山梨醇、甘露醇等试剂等均为进口分装，武汉楚诚正茂科技工程有限公司，biosharp；甲醇为色谱级，其他主要生化试剂均为国产分析级纯或进口分装。

1.1.5 仪器与设备

Agilent Technologies 1260高效液相色谱，美国Agilent公司；Thermal Cycler (My Cycler) PCR仪，美国 Bio-Rad 公司；DYY-8C型电泳仪，北京六一仪器厂；CR21G高速冷冻离心机，日本Hitachi公司；HQL300B恒温大幅振荡摇床，武汉中科科仪技术发展有限责任公司；SKP-02.420电热恒温培养箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司；Legend Micro17R高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 敲除载体的构建

以ituD基因为例，选取B.amyloliquefaciensHZ-12的基因组DNA作为模板，利用上游同源臂引物(ΔituD-AF, ΔituD-AR)和下游同源臂引物(ΔituD-BF，ΔituD-BR)分别扩增出同源臂序列A和B，产物纯化回收后通过SOE-PCR用引物ΔituD-AF、ΔituD-BR将A和B连接起来，并与T2(2)-ori载体同时用限制性内切酶SpeI和XbaI进行双酶切，回收后用T4DNA连接酶连接，采用CaCl2转化法转化到E.coliDH5α感受态细胞。钙转化成功后提取质粒进行双酶切验证并送往测序公司测序，构建成功的敲除质粒命名为T2(2)-oriΔituD。

1.2.2 基因敲除菌株的构建[12]

以ituD基因为例，将构建成功的质粒电转化入HSAM4感受态细胞中，涂布至含Kan的抗性平板，37 ℃静置培养16～18 h。挑选转化子单菌落于Kan平板上划线，培养8～12 h后进行PCR菌落验证(引物T2-F,T2-R)。将电转正确的菌株在45 ℃下进行单交换，ΔituD-YF/YR引物和T2引物验证；获得的单交换菌株在37 ℃下进行双交换，挑选在LB板上长而在Kan抗性板上不长的单菌落，用ΔituD-YF和ΔituD-YR验证，筛选到敲除菌株，命名为HSAM4ΔituD。

1.2.3 发酵培养条件

从超低温冰箱中取出保藏的菌种划线LB平板培养基中，37 ℃培养基12 h。挑取适量菌体于装有50 mL LB液体培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃，180 r/min培养9 h。吸取体积分数1.5%的菌液接种于装有25 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min发酵培养，每个菌设置3个摇瓶重复。

1.2.4 SAM液相检测[12]

取发酵液0.5 mL，加1.5 mL 0.4 mol/L高氯酸，提取1 h(每15 min振荡1次)，10 000 r/min离心5 min。取800 μL上清液，加100 μL，2 mol/L NaOH调pH。利用HPLC检测，色谱柱为XDB-C18(规格：5 μm，4.6 mm×150 mm)，检测器为紫外检测器，流动相为V(甲醇)∶V(40 mmol/L NH4H2PO42 mmol/L庚烷磺酸钠)=18∶82，流速为0.8 mL/min，进样量为20 μL，柱温30 ℃，检测波长为254 nm。

1.2.5 数据统计分析

每组实验设计3个重复，采用SPSS 20.0进行数据统计分析，评估数据差异的显著性，计算出平均值和标准偏差，采用Origin 8.5进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 ituD基因缺失对解淀粉芽孢杆菌合成SAM的影响

2.1.1ituD基因缺失菌株的构建

利用1.2.1小节中所述的方法构建重组载体T2(2)-oriΔituD，利用表3中相应的引物ΔituD-AF/AR，ΔituD-BF/BR扩增用于构建T2(2)-oriΔituD的上下游同源臂。敲除ituD基因的上下游同源臂大小分别为513和504 bp，上下游同源臂经SOE-PCR融合后的产物大小为1 017 bp，上下游同源臂SOE-PCR融合片段与T2(2)-ori质粒经酶切和酶连后转化至E.coliDH5α，选取验证正确的阳性转化子，提取质粒并且测序结果正确无误，表明敲除质粒T2(2)-oriΔituD构建成功。

将已构建完成的重组质粒T2(2)-oriΔituD电转化至HASM4中，筛选出阳性转化子，并按照1.2.2的方法进行单交换和双交换筛选突变株。经菌落PCR验证正确的双交换菌株，提取基因组DNA，并利用表3中相应的引物ΔituD-YF/YR验证原始菌株HSAM4和阳性交换突变株，片段大小分别为2 508、1 290 bp，两片段相差的长度正好是ituD基因的长度，PCR验证电泳图如图1所示。且纯化回收阳性交换突变株PCR产物，经测序确认碱基正确无误，说明缺失ituD基因的菌株HSAM4ΔituD构建成功。

1-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR验证HSAM4(2 508 bp);2-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR验证HSAM4ΔituD(1 290 bp)图1 HSAM4ΔituD菌株的PCR验证电泳图Fig.1 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔituD

2.1.2ituD基因缺失对SAM合成的影响

为了考察ituD基因的缺失对B.amyloliquefaciensHSAM4合成SAM的影响，按照1.1.3和1.2.3小节的发酵培养基和培养条件对工程菌株HSAM4ΔituD进行发酵验证，发酵周期为60 h。发酵结束后取样检测SAM产量和菌体生物量(OD600)，结果如图2所示。

图2 缺失ituD基因对SAM合成的影响Fig.2 Effect of ituD knockout on SAM fermentation

由图2可以看出，原始菌 HSAM4与HSAM4ΔituD的生物量无显著差异，说明ituD基因缺失对菌体生长无影响。此外，缺失菌株HSAM4ΔituD的SAM产量与原始菌 HSAM4相比，没有显著性提高。上述结果说明敲除ituD基因对菌体生长和产物的合成未产生显著性影响。

2.2 srfAC基因缺失对解淀粉芽孢杆菌合成SAM的影响

2.2.1srfAC基因缺失菌株的构建

敲除质粒T2(2)-oriΔsrfAC来自本实验室保存。将T2(2)-oriΔsrfAC电转化至HASM4中，筛选出阳性转化子，并按照1.2.2的方法进行单交换和双交换筛选突变株。经菌落PCR验证正确的双交换菌株，提取基因组DNA，并利用表3中相应的引物ΔsrfAC-YF/YR验证原始菌株HSAM4和阳性交换突变株，片段大小分别为 2 704和1 657 bp，两片段相差的长度正好是srfAC基因的长度，PCR验证电泳图如图3所示。纯化回收阳性交换突变株PCR产物，经测序确认碱基正确无误，说明缺失srfAC基因的菌株HSAM4ΔsrfAC构建成功。

1-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR验证HSAM4(2 704 bp);2-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR验证HSAM4ΔsrfAC(1 657 bp)图3 HSAM4ΔsrfAC菌株的PCR验证电泳图Fig.3 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔsrfAC

2.2.2srfAC基因缺失对SAM合成的影响

为了考察srfAC基因的缺失对B.amyloliquefaciensHSAM4合成SAM的影响，按照1.1.3和1.2.3小节的发酵培养基和培养条件对工程菌株HSAM4ΔsrfAC进行发酵验证，发酵周期为60 h。发酵结束后取样检测SAM产量和菌体生物量(OD600)，结果如图4所示。

图4 缺失srfAC基因对SAM合成的影响Fig.4 Effect of srfAC knockout on SAM fermentation

由图4可以看出，工程菌 HSAM4ΔsrfAC的生物量相比于原始菌没有发生显著性变化。缺失菌株 HSAM4ΔsrfAC的SAM 产量为 208.24 mg/L，比原始菌HSAM4提高了23%，差异显著。推测其原因，srfAC基因编码surfactin合成酶[17]，影响脂肽的环化与释放，减少了表面活性剂surfactin的合成，可降低副产物和发酵产泡现象，从而促进SAM的合成。

2.3 ituD基因和srfAC基因双缺失对解淀粉芽孢杆菌合成SAM的影响

2.3.1ituD基因和srfAC基因双缺失菌株的构建

将T2(2)-oriΔsrfAC电转化至HASM4ΔituD中，筛选出阳性转化子，并按照1.2.2的方法进行单交换和双交换筛选突变株。经菌落PCR验证正确的双交换菌株，提取基因组DNA，并利用表3中相应的引物ΔituD-YF/YR和ΔsrfAC-YF/YR验证原始菌株HSAM4和阳性交换突变株，与原始菌相比分别相差ituD基因和srfAC基因的长度，PCR验证电泳图如图5所示。纯化回收阳性交换突变株PCR产物，经测序确认碱基正确无误，说明缺失ituD和srfAC基因的菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC构建成功。

1-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR验证HSAM4(2 508 bp);2-ΔituD-YF 和ΔituD-YR PCR验证HSAM4ΔituDΔsrfAC(1 290 bp);3-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR验证HSAM4(2 704 bp);4-ΔsrfAC-YF 和ΔsrfAC-YR PCR验证HSAM4ΔituDΔsrfAC(1 657 bp)图5 HSAM4ΔituDΔsrfAC菌株的PCR验证电泳图Fig.5 Electrophoretogram of PCR validation forHSAM4ΔituDΔsrfAC

2.3.2ituD基因和srfAC基因双缺失对SAM合成的影响

按照1.1.3和1.2.3小节的发酵培养基和培养条件对工程菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC进行发酵验证，发酵周期为60 h。发酵结束后取样检测 SAM 产量和菌体生物量(OD600)，结果如图6所示。

图6 缺失ituD,srfAC基因对SAM合成的影响Fig.6 Effect of ituD,srfAC knockout on SAMfermentation

由图6可以看出，工程菌HSAM4ΔituDΔsrfAC的生物量相比于原始菌 HSAM4无明显变化，说明ituD和srfAC基因双缺失对菌体的生长无影响。缺失菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC的SAM的产量达222.95 mg/L，相比于原始菌 HSAM4提高了32%。这可能是敲除ituD基因和srfAC基因，同时阻断了iturin和surfactin的合成[15,17]，降低发酵副产物和发酵产泡现象，进一步提高了SAM产量。

3 结论

S-腺苷甲硫氨酸是存在于生物体中的必需功能因子[19]。在不添加甲硫氨酸的前提下，通过廉价碳源实现SAM的高效从头合成具有重要的意义。解淀粉芽胞杆菌在从头合成SAM的过程中显示了初步的效果[12]，为有效提高SAM的从头合成产量，本文基于基因敲除技术，成功构建了ituD基因缺失菌株HSAM4ΔituD，srfAC基因缺失菌株HSAM4ΔsrfAC，ituD、srfAC基因双缺失菌株 HSAM4ΔituDΔsrfAC。SAM发酵结果显示，缺失ituD、srfAC基因对菌株生长几乎无影响，双缺失菌株HSAM4ΔituDΔsrfAC的SAM产量可提高至原始菌株HSAM4的1.32倍。

ZHANG等[20]研究发现，利用BacillussubtilisATCC 6051a发酵生产环糊精糖基转移酶过程中，敲除该菌株的srfAC基因可有效控制发酵过程中的泡沫。Iturin和surfactin作为两亲性脂肽类表面活性物质，是液体深层发酵产泡的重要原因。由此推测，本研究ituD和srfAC基因的缺失，阻断了iturin和surfactin的产生，不仅可减少发酵过程中副产物的生成及不必要的能量消耗，而且可通过降低表面活性剂改善发酵产泡现象，这可能是SAM产量提高的主要原因。本研究为SAM从头合成的代谢工程育种提供了新的思路和方向。