BICC1 对骨髓基质细胞定向分化的调控作用研究

杨俊英，李晓霞

（天津医科大学基础医学院病原生物学系，天津300070）

骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSC）是成体骨髓中一种多能干细胞，能够分化为包括脂肪细胞和成骨细胞在内的多种细胞[1-2]。研究表明，BMSC 向脂肪细胞和成骨细胞的分化过程存在着一定的相互制约的动态关系，二者此消彼长，若该过程失衡将可能导致骨质疏松等疾病的发生[3-5]。因此，对BMSC 的研究可能为预防和治疗这类疾病的发生提供新的治疗方向。

双尾-C 基因（Bicc family RNA binding protein 1,Bicc1）编码产物是一种由977 个氨基酸组成的保守的RNA 结合蛋白[6]，在体外可以与RNA 结合，使mRNA 3′-UTR 在细胞质中发生多腺苷酸化，从而在转录后水平发挥调节作用[7-8]。目前发现，与Bicc1基因突变相关的小鼠模型均出现肾脏囊性变，其表型与人类多囊肾疾病病理表型高度相似[9]。有研究筛选了与BICC1 蛋白相互作用的因子，发现BICC1能够与糖异生酶、乙酰辅酶A 羧化酶α 及脂肪酸合成酶等多种酶结合[10-11]，表明其可能在多种代谢途径中发挥作用。目前，BICC1 在骨代谢相关疾病中的作用和调控机制尚不明确。本研究以BMSC 系ST2 为研究对象，探讨BICC1 对BMSC 定向分化的调控作用，为进一步的机制研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 ST2 细胞由本室保存；限制性内切酶、α-MEM 培养基、胎牛血清（FBS）、Opti-MEM、逆转录试剂盒为Thermo Fisher 产品；ClonExpress®Ⅱ克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；引物及BCIP/NBT 碱性磷酸酶显色试剂盒购自生工生物；Attractene 转染试剂为QIAGEN 产品；总RNA提取试剂盒购买自GeneMark 公司；抗坏血酸、β-甘油磷酸、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、油红 O 为 Sigma 产品；β-actin、C/EBPα、aP2 及 PPARγ 抗体为 Proteintech 产品，RunX2 抗体购自 CST 公司，ALP、Osteopontin 抗体为Abcam 产品。

1.2 方法

1.2.1 建立Bicc1 过表达质粒 小鼠ST2 cDNA 为模板扩增Bicc1 编码序列，在上下游分别引入Kpn I和Xab I 酶切位点。引物序列为：Fw: 5′-TAGCGTT TAAACTTAAGCTTGGTACCGCCACCATGGCCTCGC AGAGCGAG -3′ ；Rev:5′ -GTTTAAACGGGCCCTC TAGACTACCAGCG GCCACTGACGCT-3′。按照 95℃预变性 2 min，35 个循环（95℃ 30 s；56℃ 30 s；72℃1 min），72℃ 10 min 进行 PCR 扩增。将扩增片段进行纯化回收，利用ClonExpress®Ⅱ克隆试剂盒克隆，转化至感受态细胞DH5α，提取质粒后用KpnI/XabI进行酶切鉴定和测序，将测序正确的重组子命名为Bicc1-pcDNA3.1。

1.2.2 ST2 细胞的培养及转染 用含5% FBS、1%双抗的α-MEM 完全培养基培养骨髓基质细胞ST2于24 孔板，待细胞汇合度达70%时进行转染。对照组pcDNA3.1 与实验组Bicc1-pcDNA3.1 质粒（375 ng/孔）及转染试剂 Attractene（0.75 μL/孔）分别稀释于 Opti-MEM（25 μL/孔），混匀后室温静置5 min，然后向含有质粒的混合物中加入等量的转染试剂混合物，混匀后室温静置18 min，缓慢滴加于24 孔板（50 μL/孔）后培养，转染 12～18 h 后换 α-MEM 完全培养基。

1.2.3 成骨分化诱导 待细胞汇合度达80% 时，更换含有 50 μg/mL 抗坏血酸、5 mmol/L β-甘油磷酸钠的α-MEM 完全培养基，每3 d 换液，至第14天进行碱性磷酸酶染色。

1.2.4 成脂分化诱导 待细胞汇合度达100% 时，更换含有 0.5 μmol/L 地塞米松、0.25 mmol/L IBMX、5 μg/mL 胰岛素、50 μmol/L 吲哚美辛的 α-MEM 完全培养基，诱导3 d 后更换含有5 μg/mL 胰岛素的α-MEM 完全培养基，继续培养2 d 进行油红O 染色。

1.2.5 碱性磷酸酶染色 弃去孔板中的培养基，1×PBS 洗涤细胞2 次后用4% 多聚甲醛室温固定15 min，弃固定液，1×PBS 洗涤 1 次，NBT/BCIP 碱性磷酸酶染色剂盒避光染色15 min，用Image J 软件对染色进行半定量分析。

1.2.6 油红O 染色 弃去孔板中的培养基，1×PBS洗涤细胞 2 次，4% 多聚甲醛固定 15 min，1×PBS 洗涤 1 次，加 60% 异丙醇（200 μL/孔），1 min 后弃去，加入油红O 染液室温染色5 min。镜下观察脂滴着色情况。蒸馏水轻轻冲洗，倒置显微镜下观察细胞分化情况并拍照；待培养板晾干后，加入100 % 异丙醇（100 μL/孔），室温静置 20 min，萃取油红 O，用分光光度计测定OD520。

1.2.7 qRT-PCR 实验 细胞诱导2 d 后采用GeneMark 总RNA 提取试剂盒提取RNA 并逆转成cDNA，然后进行qRT-PCR 反应。反应体系如下：模板cDNA 2 μL，特异性上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，去离子水 2 μL。反应条件：95℃预变性 3 min，35 个循环（95℃ 5 s；56℃ 15 s；72℃ 15 s）。以 β-actin 为内参，采用2-ΔΔCt法计算实验组的各目的基因相比于对照组的mRNA 相对表达量，其中ΔCt=Ct目的mRNACt内参mRNA；ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。所有实验重复3 次，引物见表 1。

1.2.8 Western blot 细胞诱导 3 d 后提取蛋白，10%SDS-PAGE 凝胶电泳后转膜，牛奶室温封闭2 h，4℃孵一抗过夜，1×TBST 洗 3 次，每次 10 min，室温孵二抗 2 h，1×TBST 洗 3 次，每次 10 min，曝光。

1.3 统计学方法 采用 SPSS 17.0 统计软件进行分析，所有实验均重复3 次，计量资料数据以表示。组间比较采用t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建Bicc1 过表达质粒 以小鼠ST2 cDNA 为模板扩增Bicc1 编码区序列，克隆于pcDNA3.1，命名为Bicc1-pcDNA3.1。酶切鉴定（图1）及测序结果显示过表达质粒构建成功。

2.2 Bicc1-pcDNA3.1 在 ST2 细胞过表达 转染Bicc1-pcDNA3.1 后，ST2 细胞中 Bicc1 mRNA 表达水平较对照组升高15.23 倍，差异有统计学意义（n=3，P＜0.05），见图2。

表1 qRT-PCR 引物Tab 1 qRT-PCR primer

图1 Bicc1 过表达质粒酶切鉴定结果Fig 1 Identification of Bicc1 construct by enzyme digestion

2.3 BICC1 促进ST2 细胞成骨分化 转染Bicc1过表达质粒后，ST2 细胞向成骨细胞分化增强，表现为实验组成骨细胞碱性磷酸酶染色较对照组增强（图3A）。对染色结果进行半定量分析，结果显示实验组（0.504±0.006）的平均光密度值较对照组（0.368±0.003）明显升高（图3B）；成骨特异性基因osterix（Osx）、ALP、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（Oc）的mRNA 表达上调，分别为对照组的 2.93、4.19、2.55 和3.02 倍，差异有统计学意义 （n=3，P＜0.05）（图3C）。ALP、OPN 和Runx2的蛋白表达上调（图3D）。

图2 Bicc1 过表达效率Fig 2 The overexpression of Bicc1 after transfection

2.4 BICC1 抑制ST2 细胞成脂分化 转染Bicc1过表达质粒后，ST2 细胞成脂分化减少，表现为实验组油红O 染色阳性脂滴减少（图4A）。对油红O 染色结果进行定量分析，结果显示实验组（0.288±0.022）的 OD520测定值明显低于对照组（0.418±0.048）（图4B）；成脂特异性基因 PPARγ、C/EBPα、aP2 和 adipsin 的mRNA 表达分别下降 43%、38%、37% 和 49%，差异均有统计学意义（n=3，均 P＜0.05）（图4C），PPARγ、C/EBPα 和 aP2 的蛋白表达下调（图4D）。

图3 BICC1 促进ST2 成骨分化Fig 3 Overexpression of BICC1 in ST2 promoted osteoblast differentiation

图4 BICC1 抑制ST2 细胞成脂分化Fig 4 Overexpression of BICC1 in ST2 inhibited adipocyte differentiation

3 讨论

多囊肾病（PKD）是一种退行性的常染色体隐性遗传疾病，与Pkd1 和Pkd2 基因（分别编码多囊蛋白-1 和多囊蛋白-2）突变有着密切的关系[12]。近期研究发现，多囊蛋白复合物对成骨细胞也有着重要的调控作用，Pkd1 在成骨细胞中缺失，可通过多囊蛋白-1和TAZ 的相互作用从而降低Runx2 表达而增加PPARγ 表达，使得骨形成减少[13-14]。Pkd1-/-模型小鼠肾脏细胞中Bicc1 的表达出现明显下调，提示Bicc1的表达与Pkd1 密切相关[15]。

Bicc1 是果蝇双尾C 基因的同源基因，其编码产物普遍存在于从线虫到人类的各个物种中，并且序列高度保守[16]，参与胚胎内肾脏的形成[17]。Bicc1等位基因突变小鼠（Bicc1jcpk）由于终止密码子提前出现产生功能缺陷的BICC1，表现出严重的早发性PKD，与人类常染色体显性多囊肾病极为相似。通过全基因组关联性研究（GWAS）发现，Bicc1 与骨密度相关基因Bmd42、Bmd43 有着密切的联系。测量Bicc1jcpk小鼠的骨密度，结果显示在28 周时杂合Bicc1+/jcpk雄性小鼠股骨的骨密度（BMD）明显低于野生型小鼠，由此可以推测，Bicc1 基因表达减少可能导致了骨密度的降低。通过分离模型小鼠颅骨细胞进行成骨诱导，结果显示ALP 活性显著降低，成骨标志物的表达降低，证实BICC1 能够增强成骨细胞活性[18]。目前关于BICC1 在成骨分化和脂肪分化中作用的研究相对较少，尤其是脂肪分化方面鲜有报道。因此，本研究通过构建Bicc1 过表达质粒，以BMSC ST2 为细胞模型，来探讨 BICC1 对BMSC 的调控功能。

本实验中，通过转染的方式使Bicc1 在ST2 细胞中高表达，随后分析了Bicc1 对骨髓基质细胞成骨分化的作用。结果显示，Bicc1 高表达后，ST2 成骨分化显著增强，表现为成骨诱导后Bicc1 高表达组ALP 染色增强，Runx2、Osterix、Oc、OPN 及骨涎蛋白（BSP）等成骨特异性基因的mRNA 和/或蛋白表达水平均显著升高。由此推测，BICC1 可以促进BMSC 向成骨细胞分化。

骨稳态依赖于破骨细胞再吸收和成骨细胞骨形成之间的动态平衡[19]，成骨细胞的活力与骨髓基质细胞的分化密切相关[20]。成骨细胞和脂肪细胞都来源于BMSC，在分化过程中存在着彼此竞争的关系，对骨稳态的维持有着重要的作用[21-23]。因此笔者进一步检测了BICC1 对BMSC 成脂分化的调节作用。成脂诱导后，Bicc1 高表达组脂肪细胞分化明显减少，胞内储脂降低。此外，PPARγ、C/EBPα、aP2 及adipsin 等脂肪特异性基因mRNA 及蛋白表达水平均显著下降。由此推测，BICC1 可以抑制BMSC 向脂肪细胞分化。

综上，本研究结果提示BICC1 可以调节BMSC成骨及成脂分化的平衡，这可能是其影响骨稳态和骨密度的细胞学基础。BICC1 可能参与了骨质疏松骨再建紊乱的病理机制，调节BICC1 表达水平可能成为改善骨健康状态的有效策略。