辽宁省主栽的14个黑木耳菌株品种初筛*

刘岩岩，李 红，刘国丽，王 红，刘俊杰，吕立涛

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁省食用菌优质栽培重点实验室，辽宁 沈阳 110161）

黑木耳 （Auricularia auricula） 属担子菌门（Basidiomycota） 银耳目 （Auriculariales） 木耳科（Auriculariaceae）。黑木耳属于一种中温型菌类，适合在潮湿温暖的气候条件下生长。在自然条件下，多树发生在雨后，在枯死的树枝干或是树桩上生长。其子实体常覆瓦状叠生、丛生、形同人耳。刚生长时为柔软的胶质，富弹性，生长一段时间后稍带软骨质，半透明状[1]。晾晒后耳片缩小，变成黑色且硬、脆，近革质[2]。我国可人工繁育的黑木耳优良品种较少，大多数为野生菌种驯化得来，稳定性和丰产性都较差。筛选出品质优、产量高、商品性状好、市场前景佳的优良菌株对辽宁省黑木耳产业发展至关重要[3-4]。通过生物学特性和蛋白标记的方法，对辽宁省所在地区主栽的14个黑木耳栽培菌株进行研究分析[5]，为初步筛出适合辽宁省地区栽培，且产量高、品质好、抗病性强的黑木耳品种。为进一步研究栽培关键技术鉴定了前期基础，更为辽宁省黑木耳遗传育种提供的理论和实践参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试黑木耳菌株共14个，名称及来源见表1。

表1 14个供试黑木耳菌株来源Tab.1 14 tested Auricularia auricula strains from different sources

1.2 供试培养基

PDA培养基：去皮土豆200 g、磷酸二氢钾2.0 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、硫酸镁1.5 g、蛋白胨3 g、水1 000 mL；液体同工酶试验培养基：去皮土豆200 g、磷酸二氢钾3.0 g、葡萄糖20 g、硫酸镁 1.5 g、维生素B12 g、蛋白胨3 g、水1 000 mL；栽培配方：硬杂木屑86%、麦麸10%、豆粉2%、石膏1%、石灰1%。

1.3 试验方法

1.3.1 菌丝的特性试验

1）固体菌落特征：将活化后的黑木耳菌种接种到平板培养基内进行培养，每个品种5个重复，24℃避光培养5 d～8 d；每天定时查看菌丝的生长情况，当菌种已经长满整个平板时，比较各菌种菌丝生长势和测量菌落直径，计算出菌丝的生长速度。

2）液体发酵特征：将活化后的黑木耳菌种接种到液体PDA培养基中进行培养，每个品种5个重复，23℃摇床培养，转速为150 r·min-1；观察菌丝萌发时间、生长情况、平均满瓶时间及菌丝生长均一性等，同时测定菌球大小、菌球密度、菌丝体干重等指标[6-8]。

菌球大小：随机取培养基中菌球30个～50个，置于培养皿中紧密排成1排，测量总直径，求出菌球平均直径，重复3次。

菌球密度：取10 mL培养液，按一定比例准确稀释，摇匀后取一定量在直径为9 cm的培养皿中摊匀，培养皿下垫方格纸，进行计数，求出每毫克培养液中菌球个数。每个处理重复3次。

菌丝体干重：将培养好的菌液，在离心机上3 000 r·min-1离心15 min，用蒸馏水洗涤菌球，再离心，然后将菌球置于60℃恒温干燥箱内烘干至恒重，称量。

1.3.2 拮抗试验

每个平皿接种3个品种菌丝块，按“品”字形排列，重复3次后，将14个品种接种到培养基平板上，做好标识，25℃恒温避光培养10 d～15 d；当培养基平板上的菌丝相互生长到彼此接触时观察菌丝接触区并继续培养，观察不同品种之间是否出现拮抗现象。

1.3.3 同工酶试验

1） 同工酶鉴定

将黑木耳品种14个分别接入液体培养基，25℃下黑暗培养15 d后，4℃离心，洗涤，过滤收集摇瓶中的菌丝体，并用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分，称取0.5 g菌丝体放入研钵中，加入适量液氮充分研磨后，装入离心管中，加入等量研磨液，于4℃、10 000 r·min-1离心15 min。弃去沉淀取上清，置于2 mL离心管中，低温保存备用。

在4℃条件采用垂直平板聚丙烯酰胺电泳，将上清液加等体积40%蔗糖溶液，点样量为30 uL[6]。以溴酚兰为指示剂，初始电压为100 V，进入分离胶后加大电压为150 V，电泳结束蒸馏水冲洗胶板，25℃染色 30 min，出褐色的清晰酶带后漂洗数次，10%醋酸脱色固定，4℃条件下避光保存[9]。

2） 数据处理

计算电泳所得全部酶带的相对迁移率，出现的酶带记为1，不出现的为0，进行统计。利用数据软件DPS 7.05进行处理，利用数据系统聚类对其进行分析并绘制出聚类树状图。

1.3.4 栽培试验

1） 袋料制作

采用17 cm×33 cm×0.005 mm常压高密度聚乙烯塑料袋栽培，每袋装干料约为600 g[10-11]。按配方准确称取主料、辅料，并将玉米芯等原料混合均匀，再将石膏充分溶于水中，喷洒在料堆上，搅拌均匀。拌匀时要求拌2遍后用喷洒适量的水，一边加水一边搅拌确保培养料均匀混合，湿度一致。培养料含水量要求达到60%左右为佳，衡量的标准要手抓料握紧后，手指缝中能看见有水但不滴落为宜，此时手松开后料不散结成团，自然放下触地即散[12]。

2）灭菌

采用常压蒸汽灭菌锅灭菌，需迅速升温以避免时间太长导致培养料变酸；100℃条件下灭菌12 h～14 h，当温度降至到60℃以下时再取出，确保培养料熟化更加彻底。整个灭菌过程中确保搬运中轻拿轻放，避免菌袋破损造成污染[13]。

3） 接种培养

菌袋冷却到30℃以下开始接种，采用液体菌种接种法。接种前对接种室进行彻底消毒杀菌处理，控制温度低于30℃。首先将接种管和接种枪连接好，用10层的纱布包紧，高压蒸汽灭菌，在0.12 Mpa条件下灭菌40 min[14]。菌种要求接到料袋的中口内，这样接的菌种能够缩短养菌时间，每袋接种量都定量为15 mL。接种后菌袋要及时移入养菌室，养菌室内要保持清洁干燥、保温、通风良好。发菌前要对养菌室进行充分消毒再投入使用。将接种好的菌袋摆放到事先处理好的架子上，要注意轻拿轻放，摆放的层数不宜过高一般不要超过5层，用报纸盖好。养菌期间要严格控制好养菌室温度，坚持做到低温养菌，暗光培养。原则上应做到“宁干勿湿”，温度高时要用换气扇来进行通风换气[15]。一般情况下，液体菌种在25℃培养，6 h后菌种萌发，35 d左右可长满菌袋。养菌期间，如果发现菌袋内有污染应及时挑出进行单独培养。菌袋内温度较高时，要及时把中间菌袋放到边上，把上面菌袋放到下面，进行倒垛降温。

每个品种的菌株栽培袋数量为200袋，按露地全光照标准栽培模式进行管理，定时扎眼、催芽，通过对菌丝长势、污染代数、满袋时间、从耳芽到耳片分化的时间、子实体形状、产量和生育期（从接种次日到第一次采收的天数）等数据进行观察和分析。

2 结果与分析

2.1 菌丝培养特性结果

黑木耳菌株在培养基上的生长状况见表2。

表2 黑木耳菌株在培养基上的生长状况Tab.2 The growth of Auricularia auricula strains on the cultivation medium

由表2可以看出，在固体平板培养基上M1、M2、M3、M8、M9、M12菌落长势最好，菌丝洁白、粗壮、浓密，且无色素分泌，菌丝长速比其他菌株较快，都达到0.300 cm·d-1以上，其中M2菌丝长速差异显著，其他5个菌株菌丝长速无明显差异。黑木耳菌株在液体培养基上生长情况见表3。

由表3可看出，在液体培养基中各菌株菌丝体干重差异显著，M1、M2、M3、M8、M9、M12菌丝体干重较大，都达到了2.00 mg·mL-1以上，同时这6个菌株的菌球较小，密度较大，且萌发时间早、培养时间较短，生长速度较快。综合固体培养结果，初步确定M1、M2、M3、M8、M9、M12为优良品种。

表3 黑木耳菌株在液体培养基上生长情况Tab.3 The mycelial growth of Auricularia auricula strains in the liquid cultivation medium

2.2 拮抗试验结果

不同黑木耳菌株见到拮抗反应结果见表4、图1。

表4 不同黑木耳菌株间的拮抗反应Tab.4 The antagonistic reaction among the different Auricularia auricula strains

由表4可以看出，供试的14个黑木耳菌株中，M1、M5、M7、M8、M9之间无拮抗反应，M4与M11之间无拮抗，M12与M7、M9之间无拮抗，表明这几个菌株间亲缘关系较近，可能是同种异名。M2、M3、M6、M13、M14与其他菌株都没出现拮抗反应，说明M2、M3、M6、M13、M14与其他9个品种之间的亲缘关系较远可能为独自的品种。

2.3 同工酶试验结果

14个黑木耳菌丝体酯酶同工酶电泳（图谱）和14个黑木耳菌丝体酯酶同工酶谱带（Rf值）分别见图2、表5。

由图2可知，14个黑木耳菌株共检测出酶带数目达到14条，酶谱带数多为3条～10条，其中多数的有4条。由表5可知，Rf（相对迁移率） 0.605为14个菌株所共有，可以认为是黑木耳的基础酶谱带，这表明14个黑木耳品种间存在着一定的亲缘关系。个别菌株存在各自特征的酶带，如Rf=0.346，就是M3菌株的特征带；Rf=0.292则为M14菌株的特征带。M7和M9菌株的酶带大体相同，只是宽窄、颜色略有不同，说明它们的酶活力有所区别，但菌株间具有着相同的遗传基础。

表5 14黑木耳菌株酯酶同工酶的Rf值Tab.5 The Rf values of esterase isozymes about 14 tested Auricularia auricula strains

利用数据处理系统软件计算14个黑木耳菌株酶谱之间的联合系数，并对所得的酶带进行聚类系统分析，聚类分析树状图见图3。

由图3可知，在相异水平70%左右时，可以把这14个菌株分成4类：第一类包括M1、M2、M5、M7、M8、M9、M12、M13这8个菌株；第二类包括M4、M6、M10、M11这4个菌株；第三类为M14菌株；第四类为M3菌株，M14和M3这两个菌株与其它菌株亲缘关系远，自成一类。M7、M9和M12菌株；M4和M11菌株几乎没有差异，可断定为同种异名。聚类分析结果与形态特征基本趋同。

2.3.1 栽培试验

1） 发菌期调查

发菌期菌丝生长速度见图4。

由图4可以看出，M2、M3两个菌株的菌丝生长速度最快，满袋时间最短，并且菌丝浓白，生长旺盛，长势较强；其他菌株生长速度较慢，长势稍差。

2） 出耳期调查

发菌期性状调查详见表6。

由表6可看出， M2、M9、M12原基形成早，生育期短，属于早熟品种，污染率低，抗性好，产量高，差异不显著，都达到45 g/袋左右，耳片厚且干湿比较大，但是耳片呈菊花状、多筋，商品性较差；M3、M8原基形成较早，生育期较短，属于中早熟品种，污染率低，抗性好，产量较M2、M9、M12低些，但是耳片呈碗状或耳状，少筋或半筋，耳片厚且干湿比较大，颜色深黑，商品性好，所以选择这两个品种作为适合辽宁地区栽培的优良品种。

表6 各黑木耳菌株农艺性状及产量的比较Tab.6 Comparison of Auricularia auricula varieties strains in some of agronomic characters

3 讨论与结论

3.1 菌株同种异名现象较为严重

鉴别不同菌株的传统方法是利用拮抗试验来验证，不同品种菌丝间的拮抗反应是菌株之间不同遗传特性的表现[16]。通过14个不同黑木耳菌株之间的拮抗试验，来证明各菌株间可能存在着同种异名的现象。总结原因有以下几点：一是可能同一品种在不同地区的命名不同，又相互进行引种造成的；二是因为不同地区的相同菌株，通过其生长环境变化而造成生长性状上的差异；三是菌种监管不规范，个别单位引种后经过纯种分离后随意命名，导致同种异名现象十分严重。这种情况给菇农选择菌种和科研单位进行育种研究工作带来许多不便，影响食用菌菌种市场的正常秩序。

3.2 黑木耳菌株菌丝生长特性和生物学效率存在明显差异

通过拮抗试验证明不是同一品种的菌株，并不能确定就是优良菌株，要进一步进行行菌丝生长测定、栽培试验综合评价后才能确定。从菌丝的培养特性，生物学效率两个方面来观察测定。如果出现差异，也有可能是由于同一品种菌株的来源不明或者是转代次数过多而导致的。

从菌丝生长速度和长势观察分析，两者并不一定是严格对应的。同工酶就是利用具有相同或者相似的某种催化功能，但酶分子的结构有所不相同的一组酶。同工酶酶谱主要是指有编码的各条酶带基因直接决定的，其所表达出来的是分子水平的信息[17]。同工酶分析作为一种分子遗传标记的技术手段，目前已经逐渐成为真菌这一领域常用且重要的研究工具，特别是在属内菌种之间并且在品种间的分类鉴定中起到了十分有效的作用。

食用菌同一品种的菌丝体酯酶同工酶带的位置、宽窄、数目都是完全相同的。可能酶带的颜色深浅略有不同；而不同品种之间的酯酶同工酶图谱是不同的[18]。本研究中的14个黑木耳菌株的酯酶同工酶酶谱有着相同点的，即为基础酶谱带；又各自具有自身独特的酶带特征，即为特征酶谱带，可反映出不同菌株间的相互联系和差异。同工酶带越多品系越进化的观点，多一条酶带，就多一个特性或是成分中就多一种适应能力，所以特征酶带是一种进化的表现，这为黑木耳品种优劣的鉴定提供了重要依据[19-21]。

酯酶作为一个生化指标，能够反映出供试的菌株在遗传特性上的某种、某些差异。但要是培养条件各不相同，也同样会导致酯酶同工酶的差异性明显。因此在利用酯酶同工酶电泳技术对食用菌食品种进行分类或是鉴定时，试验的菌种必须是在环境条件相同的条件下培养得到的。

通过拮抗试验、菌丝培养特性观察和同工酶试验3种不同的试验方法，结合14个黑木耳菌株全光照露地栽培模式下从发菌期、出耳期及其产量的各种指标中筛选出综合性状良好、商品质量佳的菌株M3（黑3） 和M8（黑状元），比较适合辽宁本地区进一步栽培推广应用。在14个品种中，M4和M11虽然生育期长，产量不高，但是具有良好的商品性状，可作为商品性状好的育种材料，为下一步优良种质保护和遗传育种工作提供参考依据。