温度对斑玉蕈后熟阶段生理活性影响*

程泳春 ，李佳欢 ，苏财自 ，张紫华 ，胡开辉 **

（1.福建福泉鑫生物科技有限公司，福建 宁德 352200；2.福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002；3.福建农林大学（古田） 菌业研究院，福建 宁德 352200）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreous） 又名真姬菇、海鲜菇、白玉菇等，是福建省食用菌工厂化生产的重要品种之一。目前国内外对斑玉蕈的栽培研究主要集中在栽培技术优化[1]、栽培特性[2]、出菇管理[3]、子实体营养物质等方面[4-5]，缺乏对栽培菌包的培养关键因子——温度的精准研究。在栽培过程仅凭生产经验来设置培养温度，致使一年四季菌包成熟度差异大，菌包培养精准化程度低，造成产品产量、品质不稳定。

斑玉蕈是一种喜低温食用菌，菌丝满袋时间一般为50 d左右，满袋后还需要后熟阶段60 d～70 d的培养。已有研究指出，在斑玉蕈栽培技术中，温度是影响菌丝生长与菌包酶活力的重要因素，温度对菌丝生长速度、子实体产量等均有影响[6]。斑玉蕈菌丝生长最适温度为23℃，但对栽培基质的降解主要依靠菌丝分泌的如纤维素降解酶等酶系。魏巍等[7]在灵芝出芝温度对其基质物酶活影响的研究中指出，随着温度升高，木质素酶系和纤维素酶系酶活力增加，且较高的温度更利于纤维素酶的分泌，但温度超过35℃时，灵芝将无法出芝。在一定范围内，培养温度越高，酶活力越高，酶解速度快，菌包易积累营养物质，有效促进生理成熟，但过高的温度会影响食用菌子实体的形成。因此，如何确定后熟阶段斑玉蕈菌包培养的最适温度，在保证菌丝生长的同时提高胞外酶活力，缩短斑玉蕈后熟时间，成为了目前斑玉蕈生产过程中亟待解决的问题之一。

对此，通过开展不同温度对斑玉蕈后熟阶段理化性质、酶活变化以及出菇产量的影响研究，以期揭示温度影响斑玉蕈后熟阶段的原因，为工厂化生产过程中后熟阶段温度的设置提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试斑玉蕈菌株，由福建福泉鑫生物科技有限公司提供。

棉籽壳48%、麸皮20%、木屑10%、甘蔗10%、豆粕5%、玉米粉5%、石灰2%，栽培料含水量63%。机械自动打包，打包重量（1 250±20） g（湿重），121℃灭菌120 min，冷却后接种，置于25℃发菌房中黑暗培养。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 菌包外观及重量

接种后60 d，菌丝长满袋标志着菌包进入后熟阶段；选取相同重量的斑玉蕈菌包分别放入23℃、26℃、29℃、32℃、35℃的培养箱中培养，每隔10 d取样1次，称量菌包重量，观察菌丝颜色变化，设置3个重复，至120 d结束取样。

1.2.2 生理生化指标测定

1） 样品处理

将每个菌包培养基质充分搅碎混匀，称取20 g于250 mL烧杯中，加蒸馏水80 mL，25℃、150 r·min-1振荡，过滤后取滤液于50 mL离心管，9 000 r·min-1离心15 min，上清液即为提取液。

2） 菌包 pH

采用pH计测定菌包提取液的pH。

3） 还原糖含量

采用3，5-二硝基水杨酸（DNS） 比色法测定还原糖含量。

4）可溶性蛋白含量

采用考马斯亮蓝法[8]测定可溶性蛋白含量。

5）关键基质降解酶活性

纤维素酶参考姜性坚等[9]方法测定，酶活力单位定义为在50℃、pH 4.6条件下，每分钟水解底物生成1 μg葡萄糖，定义为1个酶活力单位“U”。

木聚糖酶参考王孟兰[10]等方法测定，酶活力单位定义为在50℃、pH 5.2条件下，每分钟水解底物生成1 μg的D-木糖，定义为1个酶活力单位“U”。

中性蛋白酶采用福林-酚试剂法测定，酶活力单位定义为在40℃、pH 7.2条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg的L-酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位“U”。

1.2.3 出菇试验

取样结束后（菌包培养120 d时），取5个温度下菌包各24包，同时放入相同的环境中进行出菇实验；记录原基形成时间、采收时间、出菇产量及品质，进行比较分析，观察温度对菌包出菇的影响。

1.3 数据处理

取样结束后，将不同温度培养菌包试验数据用SPSS 20.0软件进行统计学分析，并用EXCEL软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 后熟阶段不同培养温度菌包外观及重量变化

菌包60 d至出菇之前，斑玉蕈菌包转色情况，见图 1，A、B、C、D、E分别代表 23℃、26℃、29℃、32℃、35℃条件下培养的菌包。

从图1中可以看出，菌袋颜色随着时间延长逐渐转变。对比不同温度对菌包外观的影响可以发现，23℃～29℃菌袋颜色逐渐由浅白色变成浅黄色，颜色之间的差异较小；32℃菌包颜色较23℃～29℃时明显加深，且菌丝浓密度较低；35℃、70 d菌包颜色相对其他温度颜色较深，且在80 d时明显观察到绿霉感染，随后绿霉蔓延。温度对菌包重量的影响见图2。

由图2可以看出，菌包重量随着培养时间的延长逐渐降低。23℃～32℃时菌包重量随着培养时间的延长逐渐降低，32℃高温使得菌包水分蒸发增多，菌包重量略低于23℃～29℃时菌包重量；35℃在整个培养阶段重量均低于其他温度，在100 d时菌包重量显著下降。

2.2 后熟阶段不同培养温度菌包生理生化指标变化

2.2.1 pH 变化

斑玉蕈在生长过程中，利用大量的碳水化合物来维持菌体的生长和新陈代谢，同时会产生有机酸，使菌包pH下降[11]。菌包pH变化可一定程度反应菌丝消耗碳水化合物的情况。后熟阶段不同培养温度菌包pH变化见图3。

从图3可以看出，23℃～32℃时不同温度菌包的pH随着培养时间的延长逐渐下降，23℃、26℃、29℃时pH降低的速率相差不大，120 d时菌包pH均维持在5.7左右；32℃培养时，pH下降速度较为缓慢，120 d时菌包pH维持在6.26；35℃时pH先上升后在100 d时下降，120 d时pH为7.30，可能是由于霉菌感染导致斑玉蕈菌丝自溶，菌包pH上升，后期绿霉大量繁殖导致菌包pH下降。

2.2.2 还原糖含量变化

菌包中还原糖含量可以反应斑玉蕈菌丝对基质的营养利用情况，后熟阶段不同培养温度菌包还原糖含量变化见图4。

从图4中可以看出，23℃～29℃时菌包中还原糖含量逐渐上升后有所下降，且后熟期培养温度越高，菌包内积累还原糖含量越高，其中29℃时，120 d菌包的包内还原糖含量达到了 1 770.56 mg·L-1；32℃时菌包还原糖含量随培养时间延长逐渐积累，特别需注意的是100 d时还原糖含量显著提升，在120 d达 2 070.56 mg·L-1；35℃时菌包还原糖含量在120 d时仅为395.00 mg·L-1，显著低于其他试验组。

2.2.3 可溶性蛋白含量变化

菌丝对培养基质的利用是通过分泌胞外酶来降解培养基质中的大分子物质，这些酶是菌包中可溶性蛋白的重要组成部分[12]。后熟阶段不同培养温度菌包可溶性蛋白含量变化见图5。

由图5可以看出，23℃～29℃时菌包培养温度越高，可溶性蛋白含量越高，29℃时菌包可溶性蛋白含量 70 d 时达最高值 226.89 mg·mL-1；32℃培养时，可溶性蛋白含量先上升后下降，在100 d可溶性蛋白含量达到最大值 247.68 mg·mL-1；35℃时菌包可溶性蛋白含量随培养时间延长逐渐升高，在110 d时达到 362.60 mg·mL-1。

2.2.4 关键基质降解酶活性变化情况

1）纤维素酶活力变化

羧甲基纤维素酶是一种诱导酶，分布于细胞外，通过降解培养基质中的纤维素，为菌丝生长提供能源[13]。不同温度菌包的羧甲基纤维素酶随着培养时间变化情况见图6。

如图6所示，23℃～29℃培养条件下羧甲基纤维素酶活力变化情况基本一致，随培养时间的延长，各个温度酶活力在一定范围内上下波动，且培养温度越高，羧甲基纤维素酶活力越强；培养温度为32℃时，羧甲基纤维素酶活力明显高于23℃～29℃的试验组；35℃培养时，菌包中羧甲基纤维素酶持续升高且较其他培养温度差异显著。

2）木聚糖酶活力变化

木聚糖是木糖残基以β-1，4木糖苷键连接构成，是植物细胞壁中半纤维素的主要成分，木聚糖酶通过分泌到胞外降解木聚糖，不同温度对木聚糖酶活力影响见图7。

如图7所示，23℃～29℃培养条件下，木聚糖酶活力变化趋势基本一致，随培养时间的延长，木聚糖酶活力逐步增强；且随培养温度升高木聚糖酶活力同时也在增强；但与羧甲基纤维素酶不同的是，菌包培养温度为32℃时，木聚糖酶活力明显低于23℃～29℃试验组；35℃培养时，菌包中木聚糖酶持续升高且较其他培养温度差异显著。

3）中性蛋白酶活力变化

中性蛋白酶是将蛋白质分解成小分子的短肽或氨基酸一类的代谢酶，其可以帮助菌丝有效利用氮源，在菌丝生长发育过程中发挥着重要的作用[14]。不同温度对中性蛋白酶活力影响见图8。

由图8可知，23℃～29℃时中性蛋白酶活变化趋势基本相同，随培养时间延长酶活力逐渐降低，说明随着培养时间的延长菌丝逐渐成熟，所需的氮源降低。培养温度为32℃时，菌包中性蛋白酶呈逐渐下降趋势，中性蛋白酶活力明显低于23℃～29℃的试验组。培养温度35℃时，菌包中性蛋白酶活力于60 d～70 d时明显下降，可能是由于高温环境下，斑玉蕈菌丝迅速失活，蛋白酶活力下降；70 d～80 d时由于霉菌大量繁殖，分泌大量蛋白酶利用氮源，菌包蛋白酶上升，随后菌包中氮源被大量消耗，中性蛋白酶活力下降。

2.3 后熟阶段不同培养温度对出菇及农艺性状影响

斑玉蕈菌包培养过程中，不同培养温度对出菇的影响见表1。

表1 不同培养温度对斑玉蕈出菇的影响Tab.1 Effect of different culture temperature on fruiting of Hypsizygus marmoreous

从表1可看出，随培养温度提高，原基形成和采摘时间不断延长。可能是由于斑玉蕈是一种低温型变温结实性食用菌，后熟阶段培养温度低，菌丝活力强，菌丝恢复速度快，出菇周期较短，故23℃～26℃时，出菇原基形成时间只需9 d，23℃时，采摘时间较对照可提前3 d，26℃时提前1 d。值得一提的是，产量与温度在23℃～29℃时也呈现了极显著的相关性（R=0.978），随培养温度升高，出菇产量和生物学效率也不断提高。29℃时菌包单袋产量可达527.76 g，这是因为在一定范围内，温度越高，菌丝活力虽然较弱，出菇周期延长，但是菌丝分泌胞外酶活力较高，菌丝对营养成分的利用程度高，出菇产量高。但当温度过高，达到32℃时，斑玉蕈菌丝生长缓慢甚至失活，出菇周期长，产量低，而35℃时因菌包中菌丝死亡，霉菌大量污染而无法进行出菇。

不同菌包培养温度对斑玉蕈出菇外观的影响见图9，不同菌包培养温度对斑玉蕈子实体农艺性状的影响见表2。A、B、C、D分别表示23℃、26℃、29℃、32℃时菇体外观情况。

表2 不同菌包培养温度对斑玉蕈子实体农艺性状的影响Tab.2 Effect of different culture temperature on quality of Hypsizygus marmoreous

由图9、表2可以直观地看出，菌包后熟温度对斑玉蕈出菇外观及农艺性状有影响，23℃～29℃培养条件下，斑玉蕈子实体朵型适中，菌盖厚度、大小、菌柄长度差异不显著，出菇较为整齐；后熟温度为32℃时，斑玉蕈子实体朵型明显变小而且长度短，大部分菇小于成品菇（最小8 cm） 的长度要求，子实体菌盖偏小、菌柄长度偏短，出菇子实体整齐度差。

3 结论与讨论

目前，斑玉蕈生产过程中后熟阶段的温度主要凭经验设置，如何科学合理的设置菌包后熟温度是促进菌包生理成熟的关键。通过探究不同温度条件下，斑玉蕈菌包后熟阶段外观、生理生化指标以及生物学效率的的变化情况，探索温度影响斑玉蕈后熟阶段的原因，可为工厂及时调整后熟阶段培养温度提供理论依据。

从不同温度对斑玉蕈后熟阶段菌包外观和重量影响可以看出，随培养温度升高，菌包颜色加深，且重量逐渐减轻。其中，32℃时菌袋颜色较23℃～29℃时明显加深，且菌包重量较轻，可能是由于斑玉蕈菌包在后熟的过程中，菌丝老化并分泌了一些次级代谢产物导致菌包颜色变黄[15]，且温度过高导致菌包失水量大，菌包重量降低；当后熟温度为35℃时，菌包在80 d时被绿霉感染，随后蔓延。

不同温度对斑玉蕈后熟阶段pH、还原糖及可溶性蛋白含量的影响表明，23℃～29℃范围内，pH随培养时间增加不断降低，还原糖、可溶性蛋白含量先上升后下降；且随温度升高，菌包内积累的还原糖、可溶性蛋白含量越高。当后熟温度达32℃时，菌包pH下降速度缓慢，说明高温会降低食用菌对营养成分的利用速率，这与王庆武[16]的研究一致；还原糖含量在100 d时显著提高，可能是由于斑玉蕈菌丝老化，对基质利用情况减弱，导致还原糖生成速率大于吸收速率，菌包中还原糖积累；可溶性蛋白随培养时间出现先增加后下降趋势，表明温度会抑制斑玉蕈菌丝生长，可通过可溶性蛋白含量提升来增加生物体抗性[17]；35℃培养时，由于菌包中霉菌滋生繁殖，由于斑玉蕈菌丝大量裂解，胞内酶溶出，霉菌滋生菌包使其营养被大量消耗，故pH及可溶性蛋白上升、还原糖含量下降。

不同温度对斑玉蕈后熟阶段关键酶活力的影响表明，培养温度在23℃～29℃时，菌包中木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶随温度的升高酶活力增强；32℃培养条件下，菌包纤维素酶活力较高，而中性蛋白酶力下降。可能是由于过高的温度导致斑玉蕈菌丝对营养吸收能力下降，降低了对氮源的吸收利用，该现象在莫氏马尾藻中也有出现[18]；当培养温度达35℃时，菌包中纤维素酶与木聚糖酶活力上升，这可能是温度过高，绿色木霉大量滋生导致[19]。

出菇研究结果表明，后熟时期培养温度在23℃～32℃时可以正常出菇；培养温度35℃时菌包中霉菌大量滋生无法正常出菇。29℃时出菇时间较23℃、26℃时长，但产量高。而32℃时由于菌丝体老化速度过快，出菇时间较长且生物学效率低，使子实体朵型小、成品菇少，且子实体整齐度差，该结果与菌包外观、理化性质及酶活特性保持一致。

综上所述，培养温度在23℃～29℃时，菌包生物学参数一致，出菇周期与对照相同，且当温度达到29℃时，出菇产量显著提高。当温度设置32℃时，菌包各参数与低温相比存在较大差异，且产量显著降低，说明适当的提高培养温度有利于菌包后熟期营养成分积累，提高出菇产量。斑玉蕈菌包后熟期培养的极限温度介于29℃～32℃。该结果有利于斑玉蕈生产企业的控制后熟阶段温度，为工厂化生产过程中后熟阶段温度的设置提供理论依据。