自拟中药汤剂联合百令胶囊对慢性肾脏病大鼠肾脏炎症及p38 MAPK信号通路的影响*

郭亚平，郭补林**，赵亚峰，刘旭琴，鲁小庆，赵东艳，闫隐隐

(1.榆林市中医医院，陕西 榆林 719000； 2.陕西省中医医院，陕西 西安 710003)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是指由多种原因引起的肾功能下降和肾实质损害、短期或长期不可逆转的一类肾脏疾病，其病理表现为肾小球和肾间质内的炎症反应导致的肾脏纤维化，故抑制炎症反应对治疗CKD具有重要意义[1]。有文献报道，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activatedprotein kinase，p38 MAPK)信号通路参与了肾脏炎症反应，其可将外界刺激转导入细胞内，诱导产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-8等多种炎症因子，导致肾脏损害及肾纤维化，故阻断p38 MAPKs信号通路对缓解CKD进展有重要的作用[2]。中医药在CKD等多种慢性疾病治疗中有独特的优势[3]。百令胶囊为人工合成的冬虫夏草，是我国有名的滋补强壮中药，研究已证实其对CKD患者的肾功能指标有一定的改善效果[4]。本研究采用自拟中药汤剂联合百令胶囊对CKD模型大鼠进行治疗，探讨这两类中药对CKD的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 40只SPF级雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，购自成都达硕生物科技有限公司[质量合格证号为SCXKC(111)2008-24]大鼠自由摄食饮水，适应性饲养1周。

1.1.2药物与试剂 腺嘌呤(批号0183)购自美国 Amresco公司，百令胶囊(批号Z10910036)购自杭州中美华东制药有限公司，生黄芪、茯苓、党参、苍术、炒白术、巴戟天、泽兰叶、六月雪、红花、桃仁、莪术、酒大黄和水蛭粉均购自成都杏林大药房，大鼠Ⅰ型胶原C端肽(CTX-Ⅰ)ELISA试剂盒(批号ZC-35983)和大鼠Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)ELISA试剂盒(批号ZC-36009)均购自上海茁彩科技有限公司，RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自美国Promega公司，SYBR Green Gene Expression Assay购自大连Takara公司，p-p38 MAPK多克隆抗体(批号44-684G)、p38 MAPK单克隆抗体(批号33-1300)、p-JNK单克隆抗体(批号PA1-9594)、JNK单克隆抗体(批号AHO1362)、p-ERK1/2单克隆抗体(批号MA5-15174)、ERK1/2单克隆抗体(批号MA5-15134)、IL-6多克隆抗体(批号ARC0062)、IL-8单克隆抗体(批号MA5-24081)、干扰素-γ(IFN-γ)单克隆抗体(批号ARC4033)和β-actin单克隆抗体(批号MA5-15739)均购自Thermo Fisher公司，HRP标记山羊抗兔、山羊抗鼠抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1模型建立及给药 将大鼠随机分为空白组、CKD组、百令胶囊组和中药汤剂联合百令胶囊组4组，每组10只。空白组大鼠灌胃生理盐水，其他组灌胃2.5%腺嘌呤混悬液(300 mg/kg)，连续4周，建立大鼠CKD模型。第5周，空白组和CKD组灌胃生理盐水，百令胶囊组按0.625 g/kg剂量灌胃百令胶囊，中药汤剂联合百令胶囊组在百令胶囊基础上加服中药汤剂，根据大鼠和成人用药计量换算系数6.25，计算得大鼠用中药汤剂的剂量为20.94 g/kg。所有大鼠均按体质量每100 g给予1 mL剂量给药，每天灌胃1次。自拟中药汤剂制备方法：将生黄芪30 g，茯苓20 g，党参、苍术、炒白术、巴戟天、泽兰叶各15 g，六月雪30 g、红花、桃仁、莪术各12 g，酒大黄7 g，水蛭粉3 g，加入2 000 mL蒸馏水煎煮60 min，浓缩至96 mL，浓缩液中药含量为2.09×103g/L。

1.2.2标本采集 末次给药后大鼠置于代谢笼收集尿液样本，并禁食24 h，按照30 mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉，麻醉后取腹主动脉血于抗凝采血管，静置1 h后，于3 000 r/min离心10 min，收集血清，-20 ℃保存备用。采血结束后处死大鼠，摘取大鼠肾脏组织，生理盐水清洗残余血液后，将组织分为3部分，一部分置于4%多聚甲醛固定 24 h，制作HE病理切片；一部分肾脏组织置于液氮速冻后转入-80 ℃保存保用；另一部分制备匀浆液，3 000 r/min离心10 min取上清液，-80 ℃保存。

1.2.3肾功能指标及Col-Ⅰ和Col-Ⅲ检测 采用全自动生化仪检测各组大鼠血清中血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)含量，检测24 h尿白蛋白(UAlb/24 h)和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(NAG)酶含量。采用ELISA试剂盒检测肾组织匀浆液上清中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量。

1.2.4肾脏组织学观察 肾脏组织固定24 h后进行脱水、透明、包埋和切片，HE染色后观察各组大鼠肾脏组织组织学变化。

1.2.5肾组织中IL-6、IL-8和INF-γ mRNA的表达 使用总RNA提取试剂提取各组大鼠肾脏组织总RNA，并使用逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit合成cDNA，以cDNA样品为模板，对IL-6、IL-8和INF-γ mRNA表达量进行检测，引物由上海生工生物有限公司合成。IL-6引物：F端为5′-GAC TGA TGT TGT TGA CAG CCA CTG C -3′，R端为5′-AGC CAC TCC TTC T GT G AC TC T AAC T -3′。IL-8引物：F端为5′-TGG TCT CAG CCA CCCGC-3′，R端为5'-CCC TGT GGC TTG GCG G-3′。INF-γ引物：F端为5′-ATG AGT GCT ACA CGC CGC GTC TTG G-3′，R端为5′-GAG TTC ATT GAC AGC TTT GTG CTG G-3′。β-actin引物：F端为5′-GAC TGA TGT TG T TGA CAG CCA CT G C -3′，R端为5′-TAG CCA CTC CTT CTG TGA CTC TAA CT-3′。反应体系12.5 μL：SYBR Premix Ex TaqTMII 6 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，模板5 μL，ddH2O补足。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环。以β-actin为参照，用2-ΔΔCt法计算组织中各基因的相对表达量。

1.2.6肾组织中IL-6、IL-8、INF-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达 取100 mg肾组织剪碎后，根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组大鼠肾脏组织总蛋白，并用二喹啉甲酸(BCA)法进行定量。使用等量蛋白质上样，蛋白变性后选择10%SDS-PAGE进行分离，分离后的蛋白质转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(IL-6、IL-8、INF-γ、p38 MAPK、p-p38 MAPK、JNK、p-JNK、ERK1/2和p-ERK1/2和β-actin均按1 ∶400稀释)，4 ℃孵育过夜后用TBST清洗3次，每次10 min，然后用相应二抗IgG(稀释比例均为1 ∶5 000)室温孵育1 h，再用TBST清洗3次，ECL暗室显色。Bio-Rad全功能成像系统采集图像后，用Image-ProPlus分析灰度值密度，以β-actin为内参，计算各组大鼠肾脏组织中相关蛋白的相对表达量，重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血清BUN、Scr及UAlb/24 h及尿NAG酶

与空白组相比，CKD组大鼠血清中BUN、Scr含量、UAlb/24 h以及尿NAG酶明显升高(P<0.01)，表明CKD模型复制成功；与CKD组比较，百令胶囊组和中药汤剂联合百令胶囊组大鼠上述指标均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与百令胶囊组相比，中药汤剂联合百令胶囊组BUN和Scr含量均明显降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠肾功能相关指标Tab.1 Related indexes of renal function of rats in each

注：(1)与空白组比较，P<0.01;与CKD组比较，(2)P<0.01，(3)P<0.05；与百令胶囊组比较，(4)P<0.01，(5)P<0.05。

2.2 肾组织中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ表达

与空白组相比，CKD组大鼠肾组织中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与CKD组相比，百令胶囊组和中药汤剂联合百令胶囊组大鼠肾组织中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。见图1。

注：(1)与空白组比较，P<0.01;与CKD组比较，(2)P<0.01，(3)P<0.05；(4)与百令胶囊组比较，P<0.05。图1 各组大鼠肾组织中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表达Fig.1 The expression of Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in renal tissue of rats in each group

2.3 肾组织学观察

各组大鼠肾脏组织学结果显示，对照组和百令胶囊组大鼠肾小管排列正常，肾小球结构完整；CKD组大鼠肾小球结构紊乱，肾小管坏死，囊性扩张，同时伴纤维增生及大量炎性细胞浸润；与CKD组比较，百令胶囊组和中药汤剂联合百令胶囊组大鼠肾组织完整，肾小球数目增多，肾小管扩张程度降低，炎性细胞数量明显减少，而中药汤剂联合百令胶囊组肾小管扩张程度、炎性细胞数量减少更明显。见图2。

图2 各组大鼠肾脏组织学变化(HE)Fig.2 Changes of renal histology of rats in each group(HE)

2.4 肾组织中炎性因子

CKD组大鼠肾组织中IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白表达量均显著性上升，与空白组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；与CKD组相比，百令胶囊组和中药汤剂联合百令胶囊组大鼠的IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白含量均降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；与百令胶囊组比较，中药汤剂联合百令胶囊组大鼠肾组织中IL-6、IL-8和INF-γmRNA和蛋白含量降低更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：A、B为 Western blot结果，C～E为Real-time PCR 结果；(1)与空白组比较，P<0.01;与CKD组比较，(2)P<0.01、(3)P<0.05；(4)与百令胶囊组比较，P<0.05。图3 各组大鼠肾组织中IL-6、IL-8和INF-γ mRNA和蛋白表达Fig.3 The expression of IL-6, IL-8, INF-γ mRNA and protein expressions in renal tissue of rats in each group

2.5 肾组织中p-p38MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白的表达

与空白组相比，CKD组大鼠肾组织中p-p38MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白均明显升高(P<0.01)，而百令胶囊组大鼠肾组织中上述蛋白表达量均降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。与CKD组相比，中药汤剂联合百令胶囊组的p-p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。与百令胶囊组相比，中药汤剂联合百令胶囊组p-JNK蛋白表达明显降低(P<0.05)，其余蛋白表达量也减少，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

3 讨论

最新CKD流行病学调查资料显示，我国CKD的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，对我国人民的生命健康造成了极大的危害，已是肾脏疾病领域的研究热点[5]。虽然研究已证实肾组织的炎症反应及其相关的组织损伤是导致其进展至终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)的重要因素，但目前尚缺乏能有效抑制肾脏炎症反应和改善肾组织损伤的药物[6-7]。

中医认为CKD病性为本虚标实和虚实夹杂，病机为人体腑脏功能失调、气血亏损、阴阳失衡、脾肾亏虚、浊毒内蕴以及清浊不合等特点[8]。本研究采用自拟中药汤剂联合百令胶囊治疗，方中生黄芪补气升阳、益气固表、利水消肿[9]，茯苓利水渗湿、健脾益胃，党参和炒白术补中益气、健脾益肺[10]，苍术燥湿健脾，巴戟天温肾壮阳、益精血、强筋骨、祛风湿，红花、泽兰叶、桃仁、莪术和水蛭粉均有活血化瘀、行水消肿的功效，配酒大黄活血泄浊，六月雪疏风、清热、利湿、舒筋活络、解毒行淤，巧配巴戟天以温肾祛湿，疏通经脉，化散瘀滞。现代药理学表明，生黄芪[11]、酒大黄[12]、苍术[13]、莪术[14]具有调节免疫功能，党参、巴戟天具有抗氧化、防衰老、抗炎、抗疲劳、增强记忆和抗肿瘤功能[15-16]。百令胶囊与天然冬虫夏草药理活性相似，主要成分包括D-甘露醇、麦角醇、虫草酸、载体生物碱、多种氨基酸、维生素和微量元素等，在中医理论上具有补益肺肾和止血化痰之功效[17]。现代药理学表明，百令胶囊具有免疫调节、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等多种药理学活性，对肾脏、肺脏和肝脏均有保护效果[18]。研究发现，百令胶囊能改善CKD患者临床症状、提高生活质量[19]。因此，本文联合自拟中药汤剂和百令胶囊对CKD大鼠进行干预，评价治疗效果和可能机制。

注：(1)与空白组比较，P<0.01；与CKD组比较，(2)P<0.01、(3)P<0.05；(4)与百令胶囊组比较，P<0.05。图4 各组大鼠肾组织中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表达Fig.4 The expression of p-p38 MAPK, p38 MAPK, p-JNK, JNK, p-ERK1/2 and ERK1/2 protein expression in renal tissue of rats in each group

Scr和BUN是反映肾功能损害的常规检测指标。UAlb/24h与尿NAG酶被认为是早期肾损伤的主要标志物，而Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的过度沉积也是肾脏损伤的标志性病理特征[20]。本研究结果发现，CKD模型大鼠出现了典型的肾功能损伤症状，包括Scr、BUN、UAlb/24h、尿NAG、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量增加；经百令胶囊治疗后，升高的上述肾损伤指标均被明显抑制。同时，HE染色显示，百令胶囊能改善CKD大鼠肾小球结构紊乱、肾小管坏死、肾小管间质纤维化和炎性细胞浸润等病理变化，提示百令胶囊有保护肾脏的药理学活性。用中药汤剂联合百令胶囊治疗后，大鼠肾功能损伤指标被进一步降低，而肾脏组织病理学损伤也被进一步改善。表明中药汤剂能增强百令胶囊对CKD大鼠的治疗效果。Yang等[21]认为炎症反应既是导致CKD的主要原因，又是CKD发生发展导致的结果。本研究进一步验证了CKD中炎症因子的变化及百令胶囊对炎症因子的调控作用。结果表明，CKD模型大鼠肾组织中IL-6、IL-8和INF-γmRNA表达量显著性增加，百令胶囊可显著降低肾组织中IL-6、IL-8和INF-γmRNA的含量，而中药汤剂能增强百令胶囊对促炎因子的抑制，提示中药汤剂联合百令胶囊能通过调节IL-6、IL-8和INF-γ等炎症因子，从而减轻炎症反应和肾脏损害。

肾组织炎症反应的病理特征主要指肾组织炎性细胞浸润、活化以及相关信号通路的激活。多条炎症信号通路及细胞因子的活化参与了肾组织炎症反应的调控，其中，p38MAPK作为重要的炎症调控因子，其激活后进入细胞核调控多种转录因子的表达，从而促进炎症细胞的浸润与活化，加剧肾组织损伤[22]。研究发现，坎地沙坦和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯通过p38-MAPK途径改善庆大霉素诱导的大鼠肾脏损伤[23]。为了进一步探讨百令胶囊抑制大鼠肾组织炎症反应的可能作用机制，本研究检测了p38 MAPK信号通路相关蛋白表达情况。研究结果表明，CKD模型大鼠肾组织中的p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-JNK、JNK、p-ERK1/2和ERK1/2均明显显著增加，表明CKD模型大鼠肾组织中p38 MAPK信号通路被激活，百令胶囊能抑制大鼠p38 MAPK磷酸化蛋白(p-p38MAPK)及其下游的JNK和ERK通路的激活，但并无显著性差异，而用中药汤剂联合百令胶囊干预后，激活的p38 MAPK信号通路被显著性抑制。研究结果提示，模型鼠肾脏p38MAPK信号通路被激活后，p-p38MAPK进入细胞内，通过促进核内多种炎症因子的表达，导致肾组织发生炎症损伤。推测中药汤剂联合百令胶囊可通过下调p-p38MAPK的表达，从而改善CKD模型大鼠肾组织炎症损伤。

综上所述，中药汤剂联合百令胶囊可降低CKD大鼠BUN、Scr、UAlb/24 h、尿NAG酶、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ含量，改善肾脏组织病理变化和减轻炎症损伤，其机制可能与抑制p38MAPK信号通路的激活有关。但中药汤剂联合百令胶囊调控p38MAPK信号通路，改善CKD大鼠肾损伤的上游通路还有待进一步研究。