百令胶囊对支气管哮喘小鼠的治疗效果
2021-06-05张震李孟露赵振坤苏新明
张震，李孟露，赵振坤，苏新明
（中国医科大学 1.附属第一医院呼吸疾病研究所，沈阳 110001；2.附属第四医院病理科，沈阳 110032）
支气管哮喘是一种常见的慢性气道炎症性疾病，主要特征为气道炎症、气道高反应和气道重塑［1］。目前控制哮喘发作的主要药物是糖皮质激素，但已有研究［2］表明，部分哮喘患者已出现了激素抵抗现象，且长期使用激素可能产生肥胖、高血压等不良反应。百令胶囊是由传统高原中药冬虫夏草经发酵制成［3］，有研究［4］报道百令胶囊对支气管哮喘有一定的治疗作用，而且与西药联合使用可降低激素用量、减少不良反应、有效控制症状。本研究旨在探讨百令胶囊对支气管哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道高反应的治疗作用。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组和哮喘模型制备
6～8周龄Balb/c雌性小鼠48只，体质量（20±3）g，按随机数字表法分为6组：正常对照组、支气管哮喘组、布地奈德组、低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组，每组8只。于实验第 0、7、14天，分别给予支气管哮喘组、布地奈德组和低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠卵清蛋白（ovalbumin，OVA，20 μg）和氢氧化铝凝胶（2 mg）致敏。末次致敏7 d 后，除正常对照组外，其余5组均以2% OVA（20 mg/mL）超声雾化（3 mL/min）进行激发实验，30 min/次，3次/周，共8周。每次激发实验前30 min，布地奈德组小鼠给予布地奈德（2 mg）雾化给药，低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组分别给予1.875 g/kg、3.75 g/kg、6.25 g/kg百令胶囊灌胃给药。正常对照组致敏和激发实验中药品均用生理盐水代替。
1.2 小鼠气道反应性测定
末次激发实验24 h后，应用EMKA小动物肺功能检测系统测定气道阻力。将小鼠放入密闭的体描箱中，给予不同浓度的乙酰胆碱（0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL）激发，采集增强呼气间歇（enhanced pause，Penh）值3 min，用于反映气道阻力。
1.3 支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）细胞计数
各组小鼠肺功能检测结束后，水合氯醛麻醉，行支气管肺泡灌洗，回收BALF并记录回吸收量，回吸收量＞1.2 mL为合格标本。肺泡灌洗液4 ℃、1 200 r/min离心10 min，离心沉淀细胞用0.4 mL Hanks液重悬混匀，显微镜下计数BALF中细胞总数。
1.4 肺组织炎症、胶原沉积和杯状细胞观察
肺泡灌洗后取6组小鼠左肺组织进行石蜡包埋切片，分别行HE染色、AB-PAS染色、Masson 染色。
1.4.1 HE染色：石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色3～5 min，自来水冲洗5 min，室温下盐酸乙醇分化3 s，自来水冲洗30 min 返蓝，伊红染液复染1～2 min，自来水轻度冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察比较各组小鼠肺组织炎症改变。
1.4.2 AB-PAS染色：石蜡切片脱蜡至水，阿利新蓝染色10～20 min，蒸馏水洗去浮色，0.5%高碘酸水溶液氧化5～10 min，蒸馏水洗去浮色，Schiff试剂染色15 min，流水冲洗10 min，苏木素染核5 min，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察气道上皮杯状细胞增生改变。
1.4.3 Masson 染色：石蜡切片脱蜡至水，Weigert氏铁苏木素染色5 min，蒸馏水洗去浮色，1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗数分钟返蓝。丽春红酸性品红液染色5～10 min，蒸馏水洗去浮色。磷钼酸水溶液处理约3～5 min，不用水洗，苯胺蓝液复染5 min，1%冰醋酸处理1 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察上皮下胶原沉积改变。
1.5 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）免疫组织化学染色
采用SP法行肺组织α-SMA免疫组织化学染色。石蜡切片脱蜡至水，H2O2孵育5 min，微波炉抗原修复3次，6 min/次，10%胎牛血清常温封闭30 min，α-SMA一抗（1 ∶1 000）4 ℃孵育过夜。二抗（1 ∶500）孵育60 min，显微镜下控制DAB显色，复染，脱水，透明，封片。
1.6 统计学分析
2 结果
2.1 百令胶囊抑制哮喘小鼠气道高反应
小鼠气道阻力与乙酰胆碱具有浓度依赖性。与支气管哮喘组相比，低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠气道阻力均明显降低（P＜ 0.05），与布地奈德组相似，说明百令胶囊能够有效缓解哮喘小鼠的气道高反应性。见表1。
表1 各组小鼠不同浓度乙酰甲胆碱刺激后Penh值Tab.1 Penh values of mice in different groups following stimulation with acetylcholine
2.2 百令胶囊减少哮喘小鼠BALF中细胞总数
正常对照组、支气管哮喘组、布地奈德组、低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠BALF中细胞总数分别为（5.96±5.25）×104/mL、（90.84±9.94）×104/mL、（35.06±6.85）×104/mL、（82.11±9.80）×104/mL、（59.11±11.86）×104/mL、（54.06±4.90）×104/mL。支气管哮喘组BALF中细胞总数显著高于正常对照组（P＜ 0.05）。与支气管哮喘组相比，布地奈德组、低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组BALF中细胞总数均显著下降（P＜ 0.05）。且布地奈德组BALF中细胞总数低于低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组和高剂量百令胶囊组（P＜ 0.05）。
2.3 百令胶囊抑制小鼠气道炎症
HE染色结果显示，正常对照组小鼠气道周围无明显炎症细胞浸润；支气管哮喘组小鼠气道黏膜层及黏膜下层可见大量炎症细胞浸润；与支气管哮喘组相比，布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠气道和血管周围炎症细胞浸润均明显减少，平滑肌增厚减轻。见图1。
图1 肺组织HE染色 ×200Fig.1 HE staining of the lung tissue ×200
2.4 百令胶囊抑制哮喘气道黏液高分泌
AB-PAS染色结果显示，正常对照组小鼠气道上皮仅有少量PAS阳性细胞表达；支气管哮喘组PAS阳性细胞显著增加，气道黏液分泌增多；布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组杯状细胞化生均减轻。见图2。
图2 肺组织AB-PAS染色 ×200Fig.2 AB-PAS staining of the lung tissue ×200
2.5 百令胶囊抑制哮喘胶原沉积
Masson染色显示，支气管哮喘组小鼠气道黏膜中可见大量胶原纤维沉积，上皮下纤维化增加；与支气管哮喘组相比，布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组上皮下纤维化、气道壁周围胶原沉积均明显减轻。见图3。
图3 肺组织Masson染色 ×200Fig.3 Masson staining of the lung tissue ×200
2.6 百令胶囊抑制肺组织中α-SMA的表达
免疫组化染色结果显示，支气管哮喘组小鼠气道平滑肌层α-SMA表达水平显著增加，平滑肌增厚；与支气管哮喘组相比，布地奈德组及低剂量百令胶囊组、中剂量百令胶囊组、高剂量百令胶囊组小鼠肺组织内α-SMA表达均减少。见图4。
图4 肺组织α-SMA免疫组化染色 ×200Fig.4 α-SMA immunohistochemical staining of the lung tissue ×200
3 讨论
支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，其病理特征是气道炎症、气道重塑和气道高反应［5-6］。长期的炎症刺激和反复发作的喘息，导致气道高反应和气道结构改变［7］。百令胶囊是由传统的高原中药冬虫夏草经发酵而形成，主要由甘露糖醇、虫草酸、生物碱、氨基酸等相关元素构成［8］。有研究［9］报道，百令胶囊在治疗支气管哮喘上有一定作用，能显著抑制嗜酸性粒细胞浸润和炎症的进展，减轻气道高反应，并且与西药联合应用可降低激素的用量，减轻不良反应，说明百令胶囊在治疗支气管哮喘上有一定的优势。本研究的目的是明确百令胶囊在支气管哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道高反应中的作用。
本研究成功复制出具有典型气道炎症、气道重塑和气道高反应特征的慢性哮喘小鼠模型，发现百令胶囊可减少哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数，缓解肺组织炎症细胞浸润和气管上皮杯状细胞化生，减少哮喘中黏液高分泌和上皮下纤维化。但与抗炎、抗气道重塑效果极佳的布地奈德相比，百令胶囊的上述治疗效果不如布地奈德理想，说明百令胶囊在治疗哮喘时抗炎、抗气道重塑作用有限。但值得注意的是，百令胶囊能显著抑制哮喘小鼠气道高反应，且效果不输于布地奈德，说明百令胶囊在抑制哮喘小鼠气道高反应上具有独特的疗效。
近年来，大量基础和临床研究表明，百令胶囊在治疗支气管哮喘上具有显著作用。有研究［10］表明，百令胶囊可以调节支气管哮喘的免疫失衡，联合西药可快速改善急性发作期哮喘患者的临床症状，改善动脉血气，降低炎症水平，提高肺功能，从而提高临床治疗有效率。本研究也证明，百令胶囊可以抑制慢性哮喘小鼠气道炎症、气道高反应和气道重塑，尤其在治疗气道高反应上，百令胶囊与激素效果相当。
综上所述，百令胶囊在哮喘的治疗中可能发挥重要作用，未来有望作为哮喘治疗的药物。同时，百令胶囊联合激素治疗哮喘，可能改善患者的预后，减少不良反应。
