HPLC同时测定广地龙中5种核苷类成分含量

关水清，周改莲,2,*，董婧婧，林青华，黄 盼，王 倩

(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530001；2.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275；3.康美药业股份有限公司，广东 深圳 518049)

广地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier ) 的干燥体，其味咸，性寒，归肝、脾、膀胱经，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效[1-2]，临床常用于治疗高热神昏、肢体麻木、半身不遂、高血压等疾病[3-5]。广地龙因个大、质佳成为地龙药材市场的主流产品，主要产自广东、广西，为岭南地区道地药材[6-7]。目前药材市场流通的地龙来源混乱，掺杂使假现象严重[8-10]，且现行的2015版《中国药典》中地龙项下只有显微鉴别和薄层鉴别，对其指标成分没有明确规定，缺乏定量的评价方法[1]。为确保其安全有效地应用，根据国家对中药材及中药饮片标准化的要求及市场对广地龙药材需求量的增加,故有必要对广地龙药材质量进行评价。

现代研究表明[11-13]，广地龙含有蛋白质、多肽、核苷酸、氨基酸以及脂肪酸等多种化学成分，其中以次黄嘌呤为代表的核苷类成分，具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗缺血性损伤、抗菌、抗血小板聚集等多种生物活性[14-15]，其与广地龙舒张支气管、抗组胺、平喘、调节免疫功能、调节血糖、抗缺血性损伤等药理活性[16-18]具有一定的关联性，可作为广地龙药材质量评价的指标。为此，本研究采用HPLC法同时测定广地龙中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷5种核苷类成分的含量，以期为全面客观地评价广地龙药材的质量提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦)；Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(北京迪马科技有限公司)；SQP型电子分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；KQ5200B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 药材与试剂

广地龙药材分别于2018年采购于广东、广西，经暨南大学药学院马志国副教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier )的干燥体。药材低温干燥后粉碎成粗粉，过60目(相当于孔径250 μm)筛，备用。具体见表1。

尿嘧啶(批号:wkq18013109，质量分数大于等于98%)、次黄嘌呤(批号:wkq16091402，质量分数大于等于98%)、尿苷(批号:wkq17100902，质量分数大于等于98%)、肌苷(批号:wkq17111309，质量分数大于等于98%)、鸟苷(批号:wkq17092012，质量分数大于等于98%)均购自四川维克奇生物科技有限公司；甲醇(色谱纯，Fesher公司)；水为自制纯化水；其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(5∶95，体积比)等度洗脱；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样量:10 μL。按上述色谱条件进行检测，广地龙中各成分分离度良好，对照品和供试品色谱图见图1、2。

表1 20批广地龙样品来源信息

1. 尿嘧啶， 2. 次黄嘌呤， 3. 尿苷， 4. 肌苷， 5. 鸟苷图1 对照品色谱Fig. 1 HPLC chromatogram of standard sample

1. 尿嘧啶， 2. 次黄嘌呤， 3. 尿苷， 4. 肌苷， 5. 鸟苷图2 供试品色谱Fig. 2 HPLC chromatogram of test sample

2.2 混合对照品溶液的制备

分别精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品适量，置100 mL量瓶中，加质量分数0.9%生理盐水制成每1 mL分别含尿嘧啶7.42 μg、次黄嘌呤63.00 μg、尿苷31.80 μg、肌苷306.00 μg、鸟苷20.80 μg的混合对照品溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定上述过筛后的广地龙粉末约2 g，置具塞锥形瓶中，精密加入质量分数0.9%生理盐水20 mL，密塞，摇匀，称量；浸泡30 min后冰浴超声处理(功率300 W，频率40 kHz)60 min，放冷，再次称量，用生理盐水补足减失的质量，取上清液离心15 min(13 000 r/min)，即得供试品溶液。

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2节混合对照品溶液2、4、6、8、10、12、15 μL，分别注入液相色谱仪，按2.1节色谱条件测定。分别以对照品的量X(ng)为横坐标，色谱峰峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，具体结果见表2。

表2 广地龙中5种核苷类成分线性考察结果

2.5 精密度试验

精密吸取对照品溶液10 μL，连续重复进样测定6次，并分别计算尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷峰面积的RSD(n=6)，RSD值分别为 0.39%、0.56%、0.45%、0.23%和0.52%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

取1号样品按2.3节供试品溶液制备方法平行制备6份，按2.1节色谱条件进行检测，根据峰面积计算尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的RSD分别为2.36%、1.34%、1.01%、1.59%、1.33%，表明该方法的重复性好。

2.7 稳定性试验

取1号样品按2.3节制备供试品溶液，分别于0、4、6、8、10、12 h按2.1节色谱条件进行检测，根据峰面积计算尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的RSD分别为2.17%、1.73%、1.89%、0.82%、1.68%，表明广地龙供试品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收试验

精密称定已知含量的1号广地龙样品9份，每份约1 g，分别精密加入低、中、高剂量的尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷对照品，按2.3节方法制备供试品溶液，按2.1节色谱方法进行检测，计算表明尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷平均加样回收率分别为99.27%、99.14%、98.59%、98.69%、99.91%，RSD分别为0.95%、0.86%、1.01%、0.86%、1.91%，表明方法的准确度较好。

2.9 样品含量测定

取20批不同产地的广地龙样品，分别按2.3节方法制备样品溶液，按2.1节方法进样测定，分别计算各样品中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的含量，结果见表3。

表3 20批广地龙样品中核苷类成分含量测定结果

结果显示，不同产地广地龙中5种核苷类成分的含量差异很大，总含量最高为4号样品(4.565 9 mg/g) ，最低为2号样品(3.309 9 mg/g)，4、6、7、8、10、11、12、13、14、15、19、20号样品中核苷类成分总含量较高，均超过了平均含量(4.210 4 mg/g)，其余样品的总含量较少，与平均值相差较大。所有产地的广地龙中均含有尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷这5种核苷类成分，平均含量由大到小依次为：肌苷(3.022 8 mg/g)、次黄嘌呤(0.602 1 mg/g)、尿苷(0.295 9 mg/g)、鸟苷(0.214 9 mg/g)、尿嘧啶(0.074 7 mg/g)，各产地广地龙中肌苷的含量均较高，尿嘧啶含量均较低，说明广地龙中5种核苷类成分含量差异较大。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

根据核苷类成分的理化特性[19-20]，分别考察不同提取方式(加热回流提取、超声提取)、不同提取溶剂(生理盐水、纯水、体积分数10%甲醇、体积分数10%乙醇)、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80, g∶mL)和不同提取时间(30、60、90 min)对其提取量的影响。结果表明：①提取方式选择：加热回流提取和超声提取对广地龙的提取无显著性差异(P>0.05)，但超声提取法更加简捷，故选择超声的提取方法，期间发现超声时水温会随时间增长而升高，故以冰浴超声方式代替传统水浴超声，去除超声过程中温度带来的影响；②最佳提取溶剂为生理盐水；③最佳料液比为1∶10；④最佳提取时间为60 min。

3.2 色谱条件优化

色谱柱考察：通过对ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)、FNG-AQ C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)3种不同色谱柱进行比较分析，结果发现：①FNG-AQ C18色谱柱：尿嘧啶和次黄嘌呤色谱峰与样品基质色谱峰重叠现象较严重，分离效果不好；②ZORBAX SB-C18色谱柱：尿嘧啶、次黄嘌呤及尿苷色谱峰与样品基质色谱峰重叠现象较严重；③Diamonsil C18色谱柱：对供试品溶液各色谱峰的分离效果较好。综合各色谱柱的色谱峰分离效果，最终选择Diamonsil C18色谱柱。

流动相考察：在流动相的选择过程中[21-25]，通过考察乙腈-水、甲醇-水、甲醇-体积分数0.1%甲酸溶液、甲醇-体积分数0.1%乙酸溶液和甲醇-体积分数0.1%磷酸溶液对峰形的影响，发现当以甲醇-水(5∶95)作为流动相时，供试品溶液的峰形及分离效果最优。

流速及柱温考察：比较不同流速(0.6、0.8和1.0 mL/min)和不同柱温(25、30和35 ℃)下各待测成分的分离度，发现供试品溶液在流速1.0 mL/min、柱温30 ℃下有较好的分离。

检测波长考察：在波长选择的过程中[21-25]，通过DAD全波长扫描，发现供试品溶液在254 nm下各待测成分吸收值最大，因此选择254 nm作为检测波长。

总的来说，在色谱条件探索过程中发现，色谱峰峰形对流动相比例的变化较敏感，甲醇用量是一个较为敏感的因素，过大分离度不好，过小会影响色谱柱的使用寿命，但柱温对分离度影响不大。

3.3 不同批次广地龙中5种核苷类成分含量的差异

课题组通过实地调研、DNA鉴别，采购传统道地产区广东、广西的广地龙样品，保障药材来源的可靠性。查阅文献发现，运用HPLC法同时测定药材中几种化合物含量能高效地确定其含量[26-28]。因此，本研究采用HPLC法同时测定20个不同产地广地龙中5种核苷类成分的含量，发现不同产地核苷类化合物含量差异较大，有些产地含有较高或者含有较低含量的特定核苷类化合物，这为广地龙的产地确定和质量评价提供了新思路。

4 结论

本研究建立了高效液相色谱法同时测定广地龙药材中5种核苷类成分含量的方法，其色谱条件为：色谱柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水(5∶95，体积比)；流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，运行时间20 min。

本研究表明：该方法可用于不同产地广地龙药材5种核苷类成分含量的测定，对广地龙质量控制研究有显著意义。