白蛋白-生育酚纳米粒的构建及其联合化疗-光疗抗乳腺癌细胞多药耐药

高乾乾， 张娜娜， 王昊冉， 陈怡静， 刘婷婷， 沈海俊

(江苏大学医学院， 江苏 镇江 212013)

多药耐药是目前肿瘤化疗失败的重要原因，逆转多药耐药是改善肿瘤化疗效果的关键性问题[1]。纳米给药系统的出现为抗肿瘤多药耐药带来了机遇。利用纳米给药系统将光热治疗、光动力治疗、化学治疗相联合，可以显著提高肿瘤的治疗效果，已成为抗肿瘤多药耐药的新型且有效的手段[2-5]。目前，金纳米粒、硫化铜纳米粒、石墨烯纳米片等纳米材料都具有良好的光热转换能力，在肿瘤的光热治疗方面展示了良好的应用潜力[6-8]。但是，这些材料的生物安全性尚未明确，限制了其临床应用。因而，开发具有良好生物相容性的纳米材料，并能够实现化疗和光疗的联合治疗策略具有重要的意义。

本研究拟采用4种食品药品监督管理局批准使用的生物材料：D-α-生育酚琥珀酸酯(D-α-tocopherol succinate，TOS)、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)、吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)、多柔比星(doxorubicin，DOX)，构建一种负载DOX和ICG的人血清白蛋白-生育酚纳米粒(DOX-loaded HSA-ICG-TOS nanoparticles，简称DOX-HIT-NPs)。其中，DOX为广谱抗癌药，具有良好的化疗效果；ICG在近红外光照下具有光热治疗和光动力治疗的能力[9]；TOS是维生素E家族中最有效的抗癌药物，可以引起乳腺癌、前列腺癌、肺癌等多种癌细胞系的凋亡[10]，并可以增加DOX对乳腺癌耐药细胞株(MCF-7/ADR)的毒性[11]。因此，DOX-HIT-NPs有望实现化学治疗、光热治疗与光动力治疗的联合应用，逆转肿瘤的多药耐药。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

HSA(Sigma公司)；TOS、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自阿拉丁试剂有限公司；ICG(日本东京化学工业有限公司)；DOX(北京华奉联博科技有限公司)；Live/Dead细胞染色试剂盒、RPMI 1640培养基、胎牛血清(Thermo Fisher公司)；DCFH-DA探针(ROS测试盒)购自南京建成生物研究所；CCK8试剂盒(日本Dojindo公司)；红外热成像仪(德国仪器国际贸易有限公司)；808 nm光纤耦合激光器(西安赫胥尔镭得激光科技有限公司)。

1.2 DOX-HIT-NPs的制备

首先制备HIT-NPs：称取5 mg HSA溶于10 mL去离子水中，30 mg TOS溶于1 mL乙醇中， 10 mg ICG 溶于1 mL的DMSO中。向TOS溶液中加入适量的EDC和NHS，反应15 min。将10 mL HSA水溶液置于50 mL的离心管中，搅拌条件下，将100 μL TOS(EDC/NHS)溶液逐滴加入到HSA水溶液中，最后将50 μL的ICG溶液逐滴加入到上述混合溶液中，避光搅拌4 h，14 800 r/min离心20 min收集纳米粒，去离子水离心洗涤3次，将获得的HSA-ICG-TOS nanoparticles(HIT-NPs)分散到10 mL去离子水中，备用。

然后制备DOX-HIT-NPs：取1 mL HIT-NPs溶液置于离心管中，将1 mL DOX溶液(0.062 5 mg/mL)逐滴加入，避光搅拌3 h，离心收集纳米粒，去离子水超声分散、洗涤、离心，将获得的搭载DOX的HIT-NPs(DOX-HIT-NPs)分散到1 mL去离子水中，4 ℃保存备用。

1.3 DOX-HIT-NPs的表征

取超声分散后的DOX-HIT-NPs纳米粒溶液，加10 μL溶液于铜网上，自然晾干后，用透射电镜进行观察；采用粒度电位分析仪检测DOX-HIT-NPs的粒径；准备ICG、DOX和DOX-HIT-NPs水溶液，用紫外分光光度计分别进行扫描，波长范围200～900 nm。

1.4 DOX-HIT-NPs的载药量和分散性

按照将DOX负载于HIT-NPs的方法，离心后收集上清液，检测上清液在480 nm处的光密度值。通过参考标准曲线将原始数据转换为DOX浓度，计算DOX-HIT-NPs的载药量和包封率。将获得的DOX-HIT-NPs纳米粒分散到水、PBS、DMEM、RPMI-1640培养基中考察其分散性。计算公式如下：负载DOX的量(μg)= 投入DOX的总量-上清液中DOX的量；载药量 =(负载DOX的量/DOX-HIT-NPs的量)×100%；包封率 =(负载DOX的量/投入DOX的总量)×100%。

1.5 DOX-HIT-NPs的光热转换能力

配制不同浓度的DOX-HIT-NPs溶液，用近红外激光(808 nm，2 W/cm2)照射5 min，每隔30 s用浸入溶液中的热电偶测量纳米颗粒溶液的温度，并用数显温度计进行记录；近红外激光照射3 min后，用红外热成像仪拍摄照片。

1.6 DOX-HIT-NPs的细胞摄取

将MCF-7/ADR细胞按1×105个/孔接种到6孔板中，细胞贴壁后，用含有游离DOX或DOX-HIT-NPs(DOX浓度为10 μg/mL)的新鲜培养基处理细胞。随后，用PBS小心洗涤细胞3次，并用4%(w/v)多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，用PBS小心洗涤细胞3次；然后用DAPI对细胞核染色5～10 min，用PBS小心洗涤细胞3次，封片准备观察，最后使用激光共聚焦显微镜观察DOX的细胞摄取。

1.7 DOX-HIT-NPs的细胞毒性

首先，通过测定近红外光照后活性氧的水平评价DOX-HIT-NPs光动力治疗的可能性。将2×104/孔MCF-7/ADR细胞接种到24孔板中，当细胞完全贴壁后，将细胞分别暴露于完全培养基(对照组)、对照+光照、游离DOX、DOX-HIT-NPs、DOX-HIT-NPs+光照(DOX浓度为10 μg/mL)。激光照射采用808 nm，2 W/cm2，5 min。培养24 h后，除去培养基，PBS洗涤3次，然后加入用PBS稀释1 000倍的DCFH-DA探针，反应20 min左右，用PBS洗涤，荧光显微镜观察。

然后，考察DOX-HIT-NPs的体外化疗-热疗-光动力治疗的联合治疗效果。将MCF-7/ADR细胞分别接种在96孔板中(5×103个/孔)，并在细胞培养箱中孵育过夜，当细胞完全贴壁后，按照下列组别进行处理：完全培养基(对照组)、对照+光照组、游离DOX组、DOX-HIT-NPs组、DOX-HIT-NPs+光照组(DOX浓度为10 μg/mL)，处理后将细胞继续培养22 h，CCK8法测定细胞活力；另外，用24孔板同法培养与处理细胞，Live/Dead染色试剂盒进行定性分析，荧光显微镜观察染色后的活细胞(绿色)和死细胞(红色)。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 DOX-HIT-NPs的制备和表征

透射电镜观察DOX-HIT-NPs的形态(图1A)显示，DOX-HIT-NPs是近似球形的纳米粒。DOX-HIT-NPs的粒径分布图显示(图1B)，DOX-HIT-NPs呈正态分布，平均粒径为278.8 nm，粒径结果比透射电镜显示的颗粒稍大，可能是由于DOX-HIT-NPs表面的蛋白水化层导致的。

HIT-NPs用去离子水离心、洗涤3次后，将获得的纳米颗粒重新分散到水中，呈现明显的绿色(图1C)，因为TOS和HSA均为无色，只有ICG为绿色，直观地表明HIT-NPs中存在ICG。进一步地，紫外分光光谱显示DOX-HIT-NPs与游离的ICG在780 nm附近都有一个吸收峰，是ICG的特征吸收峰(图1D)。此结果证明ICG成功地结合到纳米颗粒中。与游离ICG相比，HIT-NPs的吸收峰出现了轻微的红移，这可能是由于ICG与白蛋白复合后分子构象变化所致。同样的DOX-HIT-NPs在近480 nm处具有DOX的特征吸收峰，与游离DOX的特征峰相一致，该结果证明了DOX成功加载到DOX-HIT-NPs中。

A：DOX-HIT-NPs的透射电镜照片；B：DOX-HIT-NPs的粒径分布；C：HIT-NPs分散在水中；D：ICG、DOX和DOX-HIT-NPs的紫外可见吸收光谱

图1 DOX-HIT-NPs的表征

2.2 DOX-HIT-NPs的载药量和分散性

根据DOX的标准曲线，测得DOX-HIT-NPs的载药量为16.0%，包封率为90.1%，表明投入的DOX几乎全部能搭载到HIT-NPs上，说明纳米粒具有良好的载药能力。如图2结果所示，获得的DOX-HIT-NPs可以很容易地分散到水溶液、PBS溶液、DMEM、RPMI 1640培养基中，其良好的分散性有利于纳米粒在这些体系中的稳定存在，在开展细胞实验和动物实验时不会造成聚集而沉淀。

图2 DOX-HIT-NPs在水、PBS、DMEM、RPMI 1640中分散性

2.3 DOX-HIT-NPs的光热转换能力

通过近红外激光(808 nm，2 W/cm2)照射来考察DOX-HIT-NPs的光热转换能力。如图3A所示，在相同的近红外激光照射强度下，H2O溶液上升的温度可忽略不计，而DOX-HIT-NPs能够在近红外激光照射下诱导其分散液的快速升温。在60 s内，浓度为0.21 mg/mL DOX-HIT-NPs分散液的温度从室温25.7 ℃升高到45.1 ℃，随着光照时间的延长，最高温度可达到47.9 ℃。当DOX-HIT-NPs浓度为0.35 mg/mL，分散液的最高温度可达到55.5 ℃。红外热成像仪对近红外光照射3 min后的纳米颗粒悬液进行拍照(图3B)所示，红外热成像图像与温度曲线相吻合，相同的光照条件下，纳米粒的浓度越高，温度越高。以上实验结果表明DOX-HIT-NPs具有良好的光热转换能力。

A：DOX-HIT-NPs的光热升温曲线；B：DOX-HIT-NPs的热成像图片图3 DOX-HIT-NPs的光热转换能力

2.4 DOX-HIT-NPs的细胞摄取

运用激光共聚焦显微镜考察MCF-7/ADR细胞对DOX-HIT-NPs的摄取，结果见图4，红色代表DOX的荧光，蓝色代表DAPI的荧光(DAPI主要用于标记细胞核)。图中游离DOX在MCF-7/ADR细胞中含量较少，细胞核内几乎没有(红色和蓝色荧光的无重叠)，表现出DOX耐药细胞株的典型特点。而DOX-HIT-NPs的细胞摄取明显高于游离DOX，并且细胞核内的DOX含量亦增高，说明DOX-HIT-NPs可以促进MCF-7/ADR细胞对DOX的摄取，具有一定的逆转耐药的作用。

2.5 DOX-HIT-NPs体外光动力治疗能力评价

如图5结果所示，在对照组、对照+光照组和游离DOX组都没有检测到绿色荧光，说明单纯的光照和DOX不会产生活性氧；MCF-7/ADR细胞在DOX-HIT-NPs处理后可以产生绿色的荧光，说明DOX-HIT-NPs可以产生活性氧，这主要是因为DOX-HIT-NPs中含有TOS，根据文献报道，TOS可能会影响线粒体复合体Ⅱ的泛醌结合位点，诱导活性氧的快速生成。MCF-7/ADR细胞在DOX-HIT-NPs+光照条件下产生的绿色荧光更强，说明DOX-HIT-NPs在光照后活性氧升高，提示DOX-HIT-NPs在近红外光照条件下具有光动力治疗的能力。

图4 DOX-HIT-NPs的细胞摄取(×600)

图5 不同因素处理后MCF-7/ADR细胞中活性氧产生情况(×200)

2.6 DOX-HIT-NPs的体外化疗-热疗-光动力治疗的联合治疗效果评价

如图6所示，用单纯近红外激光照射MCF-7/ADR细胞，细胞存活率为98.7%，与对照组相比无统计学意义，说明单纯光照对MCF-7/ADR细胞无影响。与游离DOX组的单纯化疗相比，用DOX-HIT-NPs治疗后，MCF-7/ADR细胞的存活率明显降低，与游离DOX组和DOX-HIT-NPs组相比，用DOX-HIT-NPs加光照治疗后，MCF-7/ADR细胞的存活率显著降低，表明近红外光照产生的光热治疗和光动力治疗显著杀伤了MCF-7/ADR细胞，显示出协同治疗的效果。

为了进一步验证DOX-HIT-NPs对MCF-7/ADR细胞的联合治疗效果，我们通过Live/Dead染色定性地观察了不同组别处理后的MCF-7/ADR细胞。结果如图7所示，与对照组相比，当激光照射后基本上都是绿色信号，说明单纯的激光照射对细胞没什么影响；当用游离DOX培养后，红色的死细胞数量较少，说明MCF-7/ADR细胞对DOX具有一定的耐药性；当用DOX-HIT-NPs处理后，与游离DOX组相比，活细胞数量明显减少，红色信号的死细胞增多，说明DOX-HIT-NPs可以有效地杀伤MCF-7/ADR细胞；当用DOX-HIT-NPs加光照处理后，死细胞数量明显增多，绿色信号的活细胞明显减少，说明在激光照射下DOX-HIT-NPs具有明显的联合治疗效果。这些结果表明DOX-HIT-NPs可以联合化疗-热疗-光动力治疗有效地杀伤耐药的癌细胞。

*：P<0.05，与DOX组比较；#：P<0.05，与DOX-HIT-NPs组比较图6 不同处理组对MCF-7/ADR的细胞毒性

图7 不同处理组MCF-7/ADR细胞的Live/Dead染色图片(×200)

3 讨论

多药耐药是肿瘤治疗的瓶颈，单一的化疗无法满足当前肿瘤治疗的需要。光热治疗法是将光热转换材料注射入体内，靶向聚集在肿瘤部位，在近红外光的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞，是一种无创/微创、恢复时间短、无耐药性的治疗方法。将传统化疗与光热治疗联合可以明显提高治疗效果[3-5]，克服肿瘤的多药耐药。光热治疗的关键是光敏剂的选择，无机纳米材料具有良好的光热转换性能，并且可以作为化疗药物的载体，实现化疗与光热治疗的结合，但是在体内的安全性还有待评估[6-8]。本研究以生物相容性优良的HSA、TOS、ICG为原料通过自组装方式成功制备了HIT-NPs，并负载DOX得到DOX-HIT-NPs。将TOS和ICG逐滴添加到HSA水溶液中，ICG可以吸附到HSA的疏水域上[12]，而TOS一方面通过疏水作用力与HSA结合[13]，另一方面通过TOS的羧基与HSA的氨基反应相互连接。由于TOS的疏水性，在水中会发生聚集而起到“粘合剂”的作用，将与之结合的HSA、与HSA结合的ICG自组装到一起，在水溶液中形成HIT-NPs[13]。由于DOX和TOS之间可以形成离子配对[14]，可以将DOX负载到HIT-NPs上，形成DOX-HIT-NPs。DOX-HIT-NPs具有良好的分散性。光热转换能力结果表明，DOX-HIT-NPs的光热转换具有浓度依赖性，即DOX-HIT-NPs浓度越高，光热效应越明显，提示可以通过控制DOX-HIT-NPs浓度来调节温度，在不损伤正常细胞的情况下有效杀伤肿瘤细胞。

根据文献报道，TOS本身也可以促进多种不同类型的肿瘤细胞的凋亡和坏死[10]。此外，TOS可以增加DOX对MCF-7/ADR细胞的毒性作用[11]，也可以诱导活性氧的生成，促进肿瘤细胞的凋亡和坏死[15-16]。我们的研究结果也证明，包含TOS的DOX-HIT-NPs可以诱导活性氧的产生，有效抑制MCF-7/ADR的生长。而DOX-HIT-NPs在光照条件下，可以明显增加活性氧的产生，说明DOX-HIT-NPs不仅可以通过光热作用杀死MCF-7/ADR细胞，还具有光动力治疗的能力，可以利用产生活性氧的方式来杀死MCF-7/ADR细胞。另外，细胞实验结果还表明DOX-HIT-NPs能够增加MCF-7/ADR对DOX的摄取，对逆转耐药起到积极的作用；与游离DOX组和DOX-HIT-NPs组相比，用DOX-HIT-NPs加光照治疗后，显著抑制了MCF-7/ADR细胞的增殖，说明DOX-HIT-NPs可以通过联合化学治疗、光热治疗和光动力治疗来杀伤MCF-7/ADR细胞，达到逆转耐药的效果。

综上所述，DOX-HIT-NPs可以将TOS抗肿瘤作用、化学治疗、光热治疗和光动力治疗等多种作用有机整合在一起，对耐药细胞株MCF-7/ADR细胞表现出显著的杀伤效果，加上DOX-HIT-NPs使用的原料已为FDA批准使用，具有优良的生物相容性，因而，DOX-HIT-NPs有望为多药耐药肿瘤的临床治疗提供新的策略。