磁性二硫化钨的层层自组装修饰：光热-化疗协同抗肿瘤

谢萌， 杨眉， 杨娜， 邓彤彤

(江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013)

目前，癌症仍然是困扰人类健康问题的重大疾病之一[1]。癌症的治疗方法有很多，光热治疗是近年发展起来的新型治疗方式，具有微创、操作简单、效率高的优点[2-3]。但长期的单一治疗会对周围正常组织造成不可避免的附带损伤[4]。因此，当前的研究集中于多元协同治疗，如光热-化疗联合治疗等[5-6]。

过渡金属二硫化钨(WS2)具有优异的药物负载性能和良好的近红外吸收能力[7-9]，在临床成像和癌症治疗领域具有良好的发展潜力[10-11]。将氧化铁掺入WS2中构成复合材料时，可以额外表现出良好的磁靶向和超顺磁性，在外加磁场作用下可以定向进入癌细胞。同时，研究表明氧化铁具有磁热和光热转化特性，产生的热能对癌细胞造成不可逆的损伤，可以进一步提高WS2的光热性能[12]。

然而，WS2在生理条件下稳定性差，进入体内后易被免疫系统吞噬[13]。因此，本文旨在合成磁性二硫化钨(magnetic WS2, mWS2)提高光热性能并层层自组装对其修饰改性，以提高其在生理条件下的稳定性，增加体内的循环周期，达到更加高效的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

小片径单层WS2纳米片(南京先丰纳米材料科技有限公司)；壳聚糖(CS，南京奥多福尼生物科技有限公司)；多柔比星(DOX，大连美仑生物有限公司)；羧甲基纤维素(CMC)、牛血清白蛋白、无水乙酸钠、六水合三氯化铁及其他分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)；人源性乳腺癌细胞MCF-7细胞株(中国科学院细胞库)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；Tecnai G2 F30 S-TWIN场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)；Nano Brook 90 Plus PALS分析仪(美国布鲁克海文仪器公司)。

1.2 mWS2的制备

称取0.036 g WS2置于干燥烧杯中，加入0.5 mL乙二醇、9.5 mL二乙二醇、0.18 g六水合三氯化铁、0.05 g丙烯酸钠和0.75 g醋酸钠，室温下机械搅拌1 h。将上述溶液装入反应釜中，200 ℃条件下反应24 h。随后将样品13 500 r/min离心30 min，去除上清液。沉淀使用乙醇和超纯水依次洗涤，然后分散至去离子水中，得到1 mg/mL 的mWS2溶液。

1.3 mWS2-CS的合成

称取0.04 g CS，分散于30 mL 0.6%冰醋酸溶液中，超声至溶解后，调节pH值至5.5～6.0，用去离子水定容至40 mL。在机械搅拌下缓慢滴加10 mL mWS2溶液。30 min后用0.22 μm滤膜过滤并收集沉淀，用去离子水洗涤后分散于50 mL水中，超声分散并通入氮气，密封保存备用。

1.4 mWS2-CS/CMC的合成

称取0.04 g CMC，加入200 mL去离子水，探头超声10 min。在机械搅拌作用下缓慢滴加20 mL mWS2-CS溶液。30 min后用0.22 μm滤膜过滤，收集沉淀并分散于20 mL去离子水中，超声分散并通入氮气，密封保存备用。

1.5 磁性考察及形貌表征

分别取适量的mWS2、mWS2-CS/CMC样品置于5 mL玻璃瓶中，将一块强磁铁置于玻璃瓶一侧，放置一段时间后观察磁性。另取适量mWS2材料烘干，使用振动样品磁强计进行磁性能检测。

将样品稀释至0.1 mg/mL滴加到铜片上，溶剂挥发后进行透射电镜表征；将10 μg/mL的样品滴加在云母片上均匀铺平，待溶剂挥发后使用原子力显微镜进行观察和拍摄。

1.6 稳定性考察

取0.02 mg/mL的mWS2、mWS2-CS和mWS2-CS/CMC溶液，依次加入等量去离子水、PBS缓冲液和RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清)。常温下避光静置，记录样品的稳定情况。

1.7 光热性能考察

将材料mWS2和mWS2-CS/CMC分别稀释到0.2、0.1、0.05 mg/mL，用808 nm，2 W/cm2的经近红外激光(NIR)照射10 min，用红外热像仪检测温度，每30 s记录一次。

1.8 非特异性蛋白吸附

将样品与牛血清白蛋白溶液按照质量比1 ∶2进行非特异蛋白吸附考察。37℃恒温振荡24 h，取出后离心弃沉淀，检测上清液的荧光值即可计算出牛血清白蛋白吸附率。

1.9 药物负载

称取适量的DOX溶于纯水中，超声分散，配制成1 mg/mL的溶液。按照DOX与材料的质量比2 ∶1进行载药，37℃恒温振荡24 h。随后取出样品，13 500 r/min离心30 min，取上清液测量光密度并计算载药量。

1.10 体外释药

将DOX、mWS2-DOX、mWS2-CS/CMC-DOX用PBS分别稀释至1 mL后置于透析袋中,将透析袋分别放入装有20 mL 不同pH值PBS缓冲液的离心管中，37℃下进行药物释放考察，并在不同时间点取样，测量透析液的荧光值并计算释药量(激发波长为488 nm，发射波长为591 nm，狭缝10 nm)。

此外，将载药后的沉淀分别用pH5.0和pH7.4的PBS分散至1 mL进行近红外促进药物释放考察。光照组用808 nm, 2 W/cm2的近红外激光照射8 min，37℃ 振荡30 min，离心并吸取0.8 mL上清液测荧光，计算药物释放量。重复此步骤，在不同时间点取样测定。非光照组除了不用光照之外，其他步骤均与光照组相同。

1.11 细胞摄取

将MCF-7细胞接种于玻底培养皿中，待细胞长至80%时，加入掺杂了荧光基团FITC的mWS2-CS/CMC材料。摄取2 h后，用4%多聚甲醛固定，并用DAPI对细胞核进行染色。染色完成后滴加防荧光淬灭剂，激光共聚焦显微镜观察材料在细胞内的分布和摄取情况。

1.12 细胞毒性

将MCF-7细胞接种于96孔细胞培养板中，37℃、5% CO2培养24 h后，将载药前后的mWS2、mWS2-CS/CMC稀释为不同浓度加入培养板中，加入PBS缓冲液的细胞作为对照。隔天通过MTT法测定细胞的相对存活率。

1.13 体外光热-化疗联合治疗

将样品分为6组进行光热-化疗联合治疗考察。第1组：PBS；第2组PBS+NIR；第3组：mWS2-CS/CMC；第4组：mWS2-CS/CMC+NIR；第5组：mWS2-CS/CMC-DOX；第6组：mWS2-CS/CMC-DOX+NIR(DOX=25 μg/mL)

将MCF-7细胞接种于96孔细胞培养板中，培养24 h后，将上述组别分别加入培养板中，并对第2、4、6组进行808 nm，2 W/cm2的激光照射处理。随后在37 ℃、5% CO2条件下继续培养24 h，并通过MTT法测定细胞的相对存活率，以此来考察光热-化疗联合治疗的效果。

1.14 统计学分析

2 结果

2.1 磁性考察及形貌表征

由mWS2和mWS2-CS/CMC的磁性考察结果(图1A、1B)可以看出，24 h后样品均被吸附在靠近磁铁的玻璃壁上，表明所合成的材料具有良好的磁性，且修饰后合成材料的磁性并没有减弱。由图1C可见，mWS2的磁滞曲线呈标准的S型，几乎没有出现磁滞现象。

mWS2的透射电镜(图1D)可见，Fe3O4磁性粒子均匀分布在WS2片层上，没有明显的团聚现象。原子力显微镜(图1E、1F)显示mWS2的厚度约为20 nm，粒径在200 nm左右，经过自组装修饰后，厚度增加到80 nm，粒径增至400 nm左右，表明mWS2-CS/CMC成功制备。

A、B：mWS2和mWS2-CS/CMC的磁性考察照片；C：mWS2的磁滞曲线；D：mWS2的透射电镜图(×97000)；E、F：mWS2和mWS2-CS/CMC的原子力显微镜图

图1 材料磁性及形貌表征

2.2 粒径和电位

WS2在经过氧化铁、CS、CMC修饰后，粒径不断增大(图2)，表明外壳材料成功地对核心进行了修饰。此外，合成的材料粒径属于纳米级别，可以较好地用于药物负载。样品的Zeta电位图可见，WS2带负电，磁性粒子修饰WS2并不改变其带电情况；mWS2-CS带正电，说明CS成功包裹到mWS2表面；mWS2-CS/CMC带负电，说明CMC成功包裹到mWS2-CS表面。此现象符合层层自组装原理，且合成的最终材料带负电有利于其在水中的稳定性。

图2 WS2、mWS2、mWS2-CS、mWS2-CS/CMC的粒径和电位图

2.3 稳定性考察

由图3可以看出，避光静置24 h时mWS2和mWS2-CS在纯水、PBS缓冲液和细胞培养液中均出现了部分沉淀，而mWS2-CS/CMC在3种溶液中均无沉淀产生，说明其稳定性在修饰后得到了明显提升，适合作为药物载体。

由左至右依次为纯水、pH为7.4的PBS缓冲液、含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液

图3 mWS2、mWS2-CS和mWS2-CS-CMC的稳定性考察

2.4 光热升温

不同浓度WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC的光照升温曲线(图4)表明，0.2 mg/mL WS2的最高温度为61℃，同浓度条件下的mWS2最高温度则升至72℃，在进行自组装修饰后，浓度为0.2 mg/mL的mWS2-CS/CMC最高温度仍可达到68℃。当浓度较低时，mWS2和mWS2-CS/CMC的温度也可以达到42℃以上，证明磁性纳米粒子的掺入使WS2的光热性能得到了明显提升。

图4 WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC的体外升温曲线图

2.5 非特异性蛋白吸附

如图5A所示，WS2吸附率为157.89%，mWS2的蛋白吸附率降至121.96%，mWS2-CS/CMC只有76.21%。结果表明，WS2经过一系列修饰后，表面的亲水性增加，降低了非特异性蛋白的吸附率，避免药物载体材料在进入人体后被巨噬细胞摄取吞噬，降低炎症反应发生的概率，提高药物的疗效和生物利用度。

2.6 药物负载

结果表明，mWS2-CS/CMC的载药量为138.44%，表现出了优异的药物负载量(图5B)。mWS2经过CS和CMC修饰后，其载药稳定性得到极大的改善，在生理环境下基本不会发生聚沉(图5C)。荧光全波长扫描光谱图显示(图5D)，当激发波长为488 nm时，DOX在520～650 nm有很强的荧光吸收，而mWS2-DOX、mWS2-CS/CMC-DOX在全波长的荧光强度都很小，说明药物载体mWS2、mWS2-CS/CMC对药物表现出一定的荧光淬灭作用，表明药物成功负载到WS2片层上，而不是吸附在修饰材料表面。

A：WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC非特异蛋白吸附率；B：WS2、mWS2和mWS2-CS/CMC的药物负载率；C：DOX(左)、mWS2-DOX(中)及mWS2-CS/CMC-DOX(右)稳定性照片；D：荧光全波长扫描(激发波长为488 nm，扫描波长为520～650 nm)

图5 材料的非特异蛋白吸附和药物负载性能

2.7 药物释放

图6A为mWS2-DOX和mWS2-CS/CMC-DOX在168 h内的药物释放曲线，结果表明，药物在pH5.0溶液中的释放量高于pH7.4环境。从图6B可以看出mWS2-CS/CMC-DOX在有(无)近红外光照射时，药物在酸性条件下的释药率均高于中性，这与体外药物释放曲线一致。

A：不同pH条件下mWS2-DOX和mWS2-CS/CMC-DOX的药物释放；B：4 h内在有(无)近红外光的情况下mWS2-CS/CMC-DOX在不同pH条件下的释放情况

图6 材料的药物释放考察

此外，在pH 5.0时，近红外光照组的释药明显增强，说明近红外光可以促进药物的释放，表现出pH和NIR双响应的释放曲线。人体内的生理环境为中性，而肿瘤部位环境偏酸性。本实验中DOX在偏酸性的环境中释放量大，有利于杀死肿瘤细胞，而减少对正常细胞的伤害。

2.8 细胞摄取和细胞毒性

MCF-7对mWS2-CS/CMC的摄取荧光图显示(图7A)，DAPI染色的细胞核产生蓝色荧光，而产生绿色荧光的mWS2-CS/CMC-FITC可以被细胞摄取并且分布在细胞质中，表明所合成的材料生物相容性好，能成功进入癌细胞。

不同浓度梯度mWS2-CS/CMC对癌细胞的杀伤作用表明(图7B)，在材料和MCF-7细胞共孵育24 h后，细胞的相对存活率均高于90%，表明mWS2-CS/CMC在一定浓度范围内几乎不存在对细胞的毒性，是一种安全理想的药物载体。从图7C可以看出，载药后的mWS2-CS/CMC-DOX同样可以进入MCF-7，并且对癌细胞产生浓度依赖的杀伤作用，随着浓度的不断升高，细胞的相对存活率不断降低，且修饰后的mWS2-CS/CMC相对于mWS2更容易进入癌细胞，表现出更理想的杀伤效果。

mWS2-CS/CMC在生理条件下具有良好的分散性和稳定性，且载药量高，光热升温性能好，因此可以作为一种优异的药物载体构建光热-化疗联合治疗的纳米平台。体外细胞的光热-化疗联合治疗效果如图8所示，当DOX含量为25 μg/mL时，单一光疗组的细胞存活率约为50%，单一化疗组细胞存活率约为35%，而联合组表现出比单一组优异的细胞杀伤作用，同样时间处理后，细胞存活率降至20%以下。近红外光照射既可以造成一定的光热消融效果，还可以在肿瘤酸性条件下促进药物的释放，使其联合治疗效果达到最大化，从而证明mWS2-CS/CMC作为一种药物载体材料在光热治疗和光热-化疗联合治疗领域表现出了良好的应用潜力。

A：MCF-7对mWS2-CS/CMC的摄取荧光图；B：不同浓度mWS2、mWS2-CS/CMC与MCF-7共孵育24 h后的细胞毒性；C：游离DOX、mWS2-DOX、mWS2-CS/CMC-DOX与MCF-7共孵育24 h的细胞存活率

图7 细胞摄取和细胞毒性考察

图8 不同处理组的MCF-7细胞的存活率

3 讨论

近几年，光热治疗因其起效快、治疗时间短、创伤小的优势而得到快速发展。但是激光随着组织深度的增加会减弱，所以需要增加光照功率和时长达到消融理想温度，这将导致对周围正常组织造成不可避免的附带损伤，从而限制其进一步应用。因此，当前的研究热点开始集中于多元协同治疗，通过构建一定的载药平台，取长补短，以达到更加全面的治疗效果。

本课题组之前成功制备了CS/海藻酸钠和CS/葡聚糖自组装修饰的磁性氧化石墨烯[14-15]，并考察了其单独光热消融癌细胞的效果，结果显示，当材料浓度达到50 μg/mL时，激光可以对50%左右的癌细胞产生杀伤作用，说明磁性粒子对氧化石墨烯的修饰取得了一定的效果。尽管如此，当适量地降低载体浓度时，磁性氧化石墨烯仍无法达到理想的光疗效果，因此本研究选用光热性能更好的WS2，一种类氧化石墨烯的二维纳米层状材料，并利用生物相容性更加优异的CMC和CS对其进行自组装修饰，制备分散性良好的mWS2-CS/CMC纳米复合材料。

研究发现，所合成的材料具有良好的磁性响应，并且当去掉外磁场后，剩磁很快会消失，表明mWS2-CS/CMC具有超顺磁性，在外加磁场的作用下，可以定向进入肿瘤细胞内，达到高效的药物传递效果。此外，稳定性考察结果表明，其在生理环境中分散性好，稳定性高，且非特异性蛋白吸附量小，进入体内后可以避免自身团聚或对非特异蛋白的大量吸附，从而降低被免疫系统清除吞噬的概率，减少炎症反应发生的同时还可以提高在体内的循环时间，达到长效的药物传递效果。

对药物负载和释放性能的研究显示，mWS2-CS/CMC对抗肿瘤药物DOX有很好的负载能力，且载药稳定性好，体外的药物释放表现出pH和NIR的双响应曲线，酸性条件下NIR照射后可以大量释放药物。由于癌细胞内的酸性环境以及材料磁靶向的定位性能，使其负载的药物在癌细胞内得到充分释放，从而达到理想的治疗效果。mWS2-CS/CMC在体外还具有良好的光照升温效果，在低浓度时，短时间就可以升至光热消融的理想温度，可以作为一种优异的光热转化剂应用于光热治疗领域。细胞实验结果表明，mWS2-CS/CMC可以很好地被MCF-7细胞摄取，并蓄积分布在细胞质中，载体本身对癌细胞几乎不产生毒性，载药后则可以表现出浓度依赖的杀伤特性。

受到之前对磁性氧化石墨烯研究的启发，本研究设计了光热-化疗联合抗癌的实验方案，通过考察单一光疗、单一化疗和联合治疗的效果对其抗癌性能进行评价。研究表明，联合治疗组比单一治疗组表现出更加优异的癌细胞杀伤效果，并且在25 μg/mL时，联合治疗组就可以杀死80%的MCF-7细胞，比磁性氧化石墨烯的效果有了大幅提升。

综上，本研究设计并制备的mWS2-CS/CMC可以作为理想的药物载体应用于癌症治疗领域，为肿瘤的多元多通道治疗提供新的设计思路。