吡格列酮对非酒精性脂肪肝模型大鼠内质网应激性高血脂、炎性因子和Caspase-12水平的影响*

陈 迪 林 萱 陈军梅 高 志

非酒精性脂肪性肝病(Non-Alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)是全球第一大慢性肝脏疾病，是代谢合并症和患者死亡的独立危险因素[1，2]。内质网(Endoplasmic Reticulum，ER)是真核细胞蛋白质和脂类合成的重要场所，有研究表明，肝细胞内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)可引起脂肪堆积、胰岛素抵抗、炎症、细胞凋亡和自噬等[3]。葡萄糖调节蛋白78(Glucose-Regulated Protein-78，GRP78)为ER中促进蛋白折叠的分子伴侣，是ERS反应的标志性蛋白，GRP78水平变化可反映ERS变化。研究能够调节，进而减轻ERS的药物有重要意义。目前已有应用吡格列酮(Pioglitazone，PIG)治疗NAFLD患者及动物模型均获肯定疗效的报道，报道者认为其机制与PIG提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗有关[4，5]。对PIG能否通过减少ERS，从而减少细胞凋亡、改善炎症与脂质代谢等相关研究鲜有报道。本研究以高脂饮食复制NAFLD大鼠模型，观察PIG对NAFLD大鼠GRP78的调节作用及对血脂相关指标甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、游离脂肪酸(FFA)及炎性因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和Caspase-12水平的影响，为进一步从ERS层面研究PIG防治NAFLD提供初步实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂

33只SPF级雄性SD大鼠，体质量200±20g，购自湖北省动物预防实验中心[许可证号：SCXK(鄂)2015-0018]。高脂饲料由北京华阜康生物科技有限公司配制(配方组成：干酪素200g，L-胱氨酸3g，麦芽糖糊精125g，蔗糖68.8g，纤维素50g，猪油245g，大豆油25g，钙磷酸盐13g，钙碳酸盐5.5g，柠檬酸钾16.5g，维生素复合物10g，胆盐2g。该配方脂肪供能60%，蛋白质供能20%，碳水化合物供能20%)。盐酸吡格列酮片(15mg/片，批号J20090134)购自天津武田药品有限公司，按人与大鼠体表面积换算等效剂量，大鼠日给药1.6mg/kg，实验时用9%生理盐水新鲜配制悬混液。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、TC、TG、FFA检测试剂盒(货号：C009-1、A110-1、A111-1、A042-1)均购自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α ELISA试剂盒(货号：E-EL-R0015c、E-EL-R0019c)购自武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；兔多抗GRP78、兔多抗Caspase-12试剂盒(货号：Ab21685、Ab62484)购自美国Abcam公司，小鼠单抗β-actin、抗小鼠二抗、抗兔二抗(货号：BM0627、BA1051、BA1054)购自武汉博士德生物工程有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0013B、P0010)购自江苏碧云天公司；ECL试剂(货号：NCI5079)购自美国Thermo公司。

1.2 NALFD大鼠模型和分组处理

本次实验大鼠经普通饲料适应性饲养1周后，随机取23只,参照谭丽萍等[6]的方法，以前述高脂饲料喂养8周(自由饮水摄食)复制NALFD模型，8周后称其体重较造模前平均增加≥20%时，再取3只大鼠，摘取肝脏进行组织病理切片，显微镜下观察肝细胞呈脂肪变性占肝小叶≥1/3，据此认为余20只大鼠均成模。成模大鼠随机平分为模型组及PIG干预组，继续高脂喂养的同时，PIG干预组给予PIG溶液2ml，1次/日(药物剂量1.6mg/kg)灌胃；模型组给予等体积生理盐水灌胃；均持续4周。余未行造模的10只大鼠作为对照组，普通饲料喂养，同模型组用生理盐水灌胃4周。

1.3 检测指标和方法

1.3.1标本采集和处理：末次灌胃后，三组大鼠禁食不禁水12h后称取质量，以3%戊巴比妥钠按0.1ml/100g腹腔注射，麻醉后下腔静脉取血5ml，4℃，3 500r/min离心10min，收集上清液于-20℃保存。而后迅速剖腹取肝脏组织，准确称重，取100mg组织块剪碎，冰浴条件下加入400μl RIPA裂解液裂解30min，移至1.5ml离心管中，4℃，12 000r/min离心5min，取上清分装于0.5ml离心管，-20℃保存。剩余肝组织按重量加入9倍体积磷酸盐缓冲液，冰浴条件下机械匀浆，5 000r/min离心10min，取上清液-20℃保存。

1.3.2血液学相关指标检测：血清ALT、TC、TG、FFA、TNF-α、IL-6水平均采用芬兰Multiskan MK3型全自动酶标仪测定，其中血清ALT、TC、TG水平采用酶法检测，血清FFA水平采用比色法测定，血清TNF-α、 IL-6水平采用ELISA检测。操作步骤严格按照仪器和试剂说明书。

1.3.3肝组织相关指标检测：肝组织匀浆上清中TNF-α、 IL-6水平采用ELISA及芬兰Multiskan MK3全自动酶标仪测定。肝组织GRP78、Caspase-12蛋白表达水平采用Western Blotting检测，取肝组织裂解后的蛋白样本采用BCA法测定蛋白浓度(DG-3022A酶标仪)，煮沸变性，取样40μg电泳1.5h，转膜，封闭。分别加入兔多抗GRP78、Caspase-12(1∶1 000)和小鼠单抗β-actin(1∶200)，4℃摇床孵育过夜。相应二抗(1∶50 000)37℃摇床孵育2h，ECL法显影，BandScan分析胶片灰度值，以GRP78/β-actin、Caspase-12/β-actin灰度比值表示肝组织GRP78、Caspase-12蛋白水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 三组大鼠肝功能、血脂有关指标血清水平比较

三组大鼠ALT、TC、TG、FFA水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，模型组大鼠血清ALT、TC、TG、FFA水平显著升高(t值分别为-8.98、-14.58、-21.31、-13.60，均P<0.01)；PIG干预组上述指标与模型组比较均明显降低(t值分别为5.97、2.79、4.74、4.87，P<0.05或P<0.01)，但与对照组比较仍有明显升高(t值分别为-4.55、-10.86、-11.17、-6.65，均P<0.01)。见表1。

2.2 三组大鼠血清和肝组织匀浆TNF-α、 IL-6水平比较

三组大鼠血清及肝组织匀浆TNF-α、 IL-6水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，模型组大鼠血清及肝组织匀浆TNF-α、 IL-6水平显著升高(t值分别为-14.27、-23.17、-16.62、-14.23，均P<0.01)；PIG干预组上述指标与模型组比较均明显下降(t值分别为3.03、23.77、13.35、11.03，均P<0.01)，但仍然高于对照组水平(t值分别为-10.79、-3.37、-3.20、-4.46，均P<0.01)。见表2。

表1 三组大鼠肝功能和血脂有关指标血清水平比较均=10)

注:与对照组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

表2 三组大鼠血清和肝组织匀浆上清TNF-α、 IL-6水平比较均=10)

注:与对照组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01

2.3 三组大鼠肝组织GRP78、Caspase-12蛋白表达水平比较

图1显示，三组大鼠肝组织中均有GRP78、Caspase-12蛋白表达，模型组表达最强，PIG干预组次之，对照组最弱。两组蛋白电泳条带灰度比值定量分析显示，三组大鼠肝组织GRP78、Caspase-12表达水平差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较，模型组显著升高(t值分别为-10.36、-20.02，均P<0.01)；PIG干预组与模型组比较明显降低(t值分别为7.51、8.06，均P<0.01)。但仍高于对照组(t值分别为-3.66、-11.00，均P<0.01)。见表3。

图1 三组大鼠GRP78、Caspase-12蛋白电泳图

表3 三组大鼠肝组织GRP78、Caspase-12蛋白表达水平比较(灰度比值，均=10)

注:与对照组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01

3 讨 论

NAFLD是目前引起肝酶异常的最常见病因之一[7]，其发生除与饮食习惯有关外，还与肝脏脂肪代谢紊乱有关[8]。NAFLD发病机制十分复杂，除经典的“二次打击”学说，ERS的作用已被国内外学者广泛重视[9]。ERS主要表现为未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response，UPR)、内质网超负荷和胆固醇级联调节三种反应形式[10]。其信号通路分别是肌醇需要蛋白1(Inositol-Requiring Protein 1，IRE1)、激活转录因子-6(Activating Transcription Factor 6，ATF6)和蛋白激酶样ER激酶(Protein Kinase RNA-Like ER Kinase，PERK)[11]；它们的ER腔内端都具有GRP78结合位点，正常情况下均处于非激活状态，当发生ERS时，GRP78即与错误折叠蛋白反应，激活IRE1、ATF6、PERK[12]。如果ERS程度过强或持续时间过长，补救措施不足以恢复应激状态的ER稳态，UPR即通过CHOP(C/EBP Homologous Protein)、JNK(c-Jun N-terminal Kinases)、Caspase-12介导的信号通路触发细胞凋亡[13]。

本实验通过检测三组大鼠血清ALT、TC、TG、FFA、TNF-α、IL-6水平及肝组织匀浆中TNF-α、IL-6，肝组织GRP78、Caspase-12蛋白表达水平，显示如下结果：(1)造模大鼠血清ALT、TC、TG、FFA水平较对照组大鼠显著升高，并出现肝细胞脂肪变等病理学特点，表明NAFLD模型复制成功。(2)模型组大鼠ERS标志物GRP78蛋白表达水平较对照组显著增加，说明高脂诱导的NAFLD大鼠存在ERS；而且该组大鼠血脂指标、炎性细胞因子和Caspase-12蛋白表达水平也相应升高。(3)PIG干预后，NAFLD大鼠ESR减少GRP78蛋白表达水平降低，血脂、炎性细胞因子和Caspase-12蛋白表达同步下降。这些结果可能与以下机制有关。成模大鼠发生ERS时，其ATF6、PERK及IRE1 信号通路激活固醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulatory Element Bingding Proteins，SREBP)，可增加FFA、TG、TC等的合成和血液浓度[10]。当采用PIG干预后，升高的TC、TG、FFA水平均较模型组下降，说明PIG可能改善ESR介导的脂质代谢紊乱。相关研究表明，ER超负荷反应可通过ER 腔释放出 Ca2 +诱导大量活性氧产生，从而诱导核转录因子-κB(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)活化，后者可诱导TNF-α、IL-6等慢性炎症因子的分泌[14，15]，故ERS升高的NAFLD大鼠不论血清或肝组织中TNF-α、IL-6水平均可升高，但PIG干预随即改善了ESR相关性炎症，使TNF-α、IL-6水平低于模型组。Pal等[16]研究发现，Caspase-12信号通路是ERS介导凋亡的特异通路。NAFLD大鼠Caspase-12蛋白表达水平显著升高，提示NAFLD进程可能与ESR介导的肝细胞凋亡有关。应用PIG可能阻断NAFLD大鼠ESR介导的Caspase-12细胞凋亡通路，有效保护肝细胞。

综上所述，PIG防治NAFLD的作用可能与其减少ERS从而改善脂质代谢和炎症等有关。对于肝细胞Caspase-12蛋白水平与ERS同步变化，介导细胞凋亡的作用和机制有待进一步研究。

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