连翘苷通过APPL1对缺氧/复氧诱导心肌细胞损伤的影响

刘晓东 闫业军

再灌注治疗是急性心肌梗死最有效的方法，可减少缺血损伤，限制梗死范围。然而，再灌注可能诱发心肌损伤，包括心肌细胞死亡，导致心肌梗死范围的扩大。心肌缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤可能影响再灌注治疗的有益作用[1]，探讨减少I/R损伤所致细胞死亡方法也一致受到临床关注。已有研究表明，中药连翘苷可以保护MPP+诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞损伤[2]；连翘苷对脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)诱导的BV2小鼠小胶质细胞炎症反应具有抑制作用[3]。APPL1(Adaptor Protein Containing PH Domain,PTB Domain and Leucine Zipper Motif 1)是含有多个结构域的衔接蛋白，在很多疾病，包括心血管疾病及心肌I/R损伤机制中起重要作用。李波等[4]最近报道LPS处理后心肌细胞的APPL1mRNA水平和蛋白水平均显著降低，过表达APPL1能够降低LPS诱导的心肌细胞氧化损伤，减少细胞凋亡。APPL1参与了I/R诱导的晚期纤维化的发病机制，并被姜黄素显著上调[5]。但连翘苷能否通过调控APPL1表达影响缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation，H/R)心肌细胞损伤目前尚未可知。本研究采用H/R损伤大鼠心肌细胞H9C2复制I/R模型，观察连翘苷对H/R心肌细胞氧化应激和凋亡的影响以及APPL1在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验药品、心肌细胞和主要试剂

连翘苷(批号110821-201816，20mg/支)购自中国食品药品检定研究院。大鼠心肌细胞H9C2购自中国科学院细胞库(细胞编号：GNR5)，DMEM培养基(货号12800017)、胎牛血清(批号： 1009-141)购自美国GIBCO公司，Lipofectamine 2000转染试剂(批号：11668019)购自美国Invitrogen公司，丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量检测试剂盒(批号S0131)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性检测试剂盒(批号S0109)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)活性检测试剂盒(批号S0058)、异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ(Annexin Ⅴ-Fluorescein Isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)细胞凋亡检测试剂盒(批号C1062)均购自碧云天生物技术公司；B细胞淋巴瘤/白血病-2(B Cell Lymphoma/Lewkmia-2，Bcl-2)(批号3498)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)(批号5023)、APPL1抗体(批号3858)均购自美国Cellular Signaling Technology公司；辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物公司；逆转录试剂盒(批号：RR036A)、实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qPCR)试剂盒(批号：RR390A)购自日本TaKaRa公司，pcDNA、pcDNA-APPL1、si-NC、si-APPL1购自广州锐博生物有限公司。

1.2 心肌细胞分组与处理

心肌细胞H9C2加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育，选取对数生长期细胞，将其分为对照组(Con组：正常培养的心肌细胞H9C2)，模型组(H/R组：心肌细胞H9C2放入5% CO2、95% N2的培养箱中缺氧处理3 h，之后放入5% CO2、95% O2的培养箱中复氧处理4h[6])，连翘苷干预组：使用DMEM培养基溶解连翘苷后配制成1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L三种浓度应用液，分别加入H9C2培养24h后进行H/R处理[2]，形成H/R+连翘苷低、中、高剂量组。

1.3 细胞转染及分组

心肌细胞转染采用Lipofectamine 2000试剂，按常规操作，即转染前24h，将细胞接种至6孔板，约70%汇合时，将pcDNA、pcDNA-APPL1、si-NC、si-APPL1分别利用脂质体转染法转染心肌细胞24h后加入100μmol/L连翘苷处理24h；再进行H/R处理。分别标记为H/R+pcDNA组、H/R+pcDNA-APPL1组、H/R+连翘苷+si-NC组、H/R+连翘苷+si-APPL1组。最后与1.2各组同法进行以下检测。

1.4 ELISA检测氧化应激指标MDA、SOD、GSH-Px

严格按照试剂盒说明书操作。收集以上各组细胞，使用胰酶消化后，采用Bio-Rad 450型酶标仪(美国伯乐公司生产)分别检测心肌细胞中MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

选取以上各组心肌细胞，根据细胞凋亡检测试剂盒说明书，收集5×105个细胞，离心后加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，加入10μl 碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10-20min，之后上BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司生产)检测。细胞凋亡率(%)=早期凋亡细胞(%)+晚期凋 亡细胞(%)。

1.6 蛋白质印迹法(Western blot)检测Bcl-2、Bax、APPL1蛋白

各组心肌细胞加入RIPA裂解液，提取总蛋白，取30μg蛋白样品进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gelelectrophoresis，SDS-PAGE)，转聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜，PVDF膜在脱脂牛奶中封闭，置于1∶1 000稀释的Bcl-2、Bax和1∶2 000稀释的APPL1一抗，4℃孵育过夜后，置于1∶5 000稀释的二抗中，室温孵育1.5h，经ECL发光显影，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)作为内参照。应用Quantity One软件分析电泳条带灰度比值，比值越大蛋白表达量越高。

1.7 qPCR检测APPL1 mRNA

使用TRIzol试剂提取各组心肌细胞总RNA，逆转录成cDNA，将cDNA与qPCR试剂盒正向和反向引物混合，在ABI 7500 PCR仪(美国应用生物系统公司生产)进行反应。APPL1正向引物序列为5'-GCC CGC AGA CAA GGT CTT TA-3'，反向引物序列为5'-TGA GGT CAG GTG TGT TGC TG-3'。内参β肌动蛋白(β-actin)正向引物序列为5'-CCA ACC GCG AGA AGA TGA-3'，反向引物序列为5'-CCA GAG GCG TAC AGG GAT AG-3'。根据2-ΔΔCt方法计算心肌细胞中APPL1 mRNA表达。

1.8 统计学处理

2 结 果

2.1 连翘苷对H/R心肌细胞氧化应激指标的影响

与Con组比较，H/R组心肌细胞中MDA含量明显增加(t=10.60，P<0.01)，SOD和GSH-Px活性均显著降低(t=25.43、22.55，P<0.01)；与H/R组比较，H/R+连翘苷低剂量组、H/R+连翘苷中剂量组、H/R+连翘苷高剂量组MDA含量随药物浓度升高逐渐明显减少(t=4.02、6.57、8.66，P<0.01)，SOD活性(t=9.56、17.31、19.17，P<0.01)、GSH-Px活性(t=16.55、21.97、23.82，P<0.01)均逐渐显著升高，但尚未到达Con组水平。见表1。

表1 连翘苷干预后H/R心肌细胞氧化应激水平变化均=9)

注:与Con组比较，1)P<0.01；与H/R组比较，2)P<0.01；与H/R+连翘苷低剂量组比较，3)P<0.01；与H/R+连翘苷中剂量组比较，4)P<0.01

2.2 连翘苷对H/R心肌细胞凋亡率和凋亡蛋白表达的影响

与Con组比较，H/R组心肌细胞的凋亡率和Bax蛋白表达量明显增加(t=21.95、21.47，P<0.01)，Bcl-2蛋白水平显著降低(t=20.57，P<0.01)；与H/R组比较，H/R+连翘苷低剂量组、H/R+连翘苷中剂量组、H/R+连翘苷高剂量组凋亡率(t=5.20、10.68、18. 06，P<0.01)和Bax蛋白表达量(t=4.99、9.60、15.39，P<0.01)均随药物浓度升高逐渐明显减少，但仍高于Con组；Bcl-2蛋白水平显著升高(t=8.49、15.00、19.55，P<0.01)，接近Con组水平。见图1和表2。

注：A，凋亡相关蛋白电泳图(W-B)；B1-B5，各组细胞凋亡流式图图1 连翘苷对H/R心肌细胞凋亡的影响

组 别凋亡率(%)Bcl-2蛋白(灰度比值)Bax蛋白(灰度比值)Con组6.98±0.760.69±0.060.31±0.03H/R组27.36±2.681)0.23±0.031)0.79±0.061)H/R+连翘苷低剂量组21.45±2.112)0.35±0.032)0.66±0.052)H/R+连翘苷中剂量组15.98±1.742)3)0.48±0.042)3)0.54±0.052)3)H/R+连翘苷高剂量组9.65±0.992)3)4)0.61±0.052)3)4)0.42±0.042)3)4)F值194.23165.88146.07

注:与Con组比较，1)P<0.01；与H/R组比较，2)P<0.01；与H/R+连翘苷低剂量组比较，3)P<0.01；与H/R+连翘苷中剂量组比较，4)P<0.01

2.3 连翘苷干预H/R心肌细胞对APPL1 mRNA和蛋白表达的影响

与Con组比较，H/R组心肌细胞APPL1 mRNA(t=24.55，P<0.01)和蛋白表达量(t=18.34，P<0.01)明显减少；与H/R组比较，H/R+连翘苷低剂量组、H/R+连翘苷中剂量组、H/R+连翘苷高剂量组心肌细胞内的APPL1 mRNA(t=8.43、11.97、15.76，P<0.01)和蛋白表达量(t=7.78、13.80、18.01，P<0.01)显著增加，基本接近Con组水平。见图2和表3。

图2 连翘苷对H/R心肌细胞APPL1蛋白表达电泳图

组 别APPL1 mRNAAPPL1蛋白Con组1.00±0.060.62±0.06H/R组0.41±0.041)0.21±0.031)H/R+连翘苷低剂量组0.59±0.052)0.32±0.032)H/R+连翘苷中剂量组0.73±0.072)3)0.44±0.042)3)H/R+连翘苷高剂量组0.88±0.082)3)4)0.56±0.052)3)4)F值128.53134.53

注:与Con组比较，1)P<0.01；与H/R组比较，2)P<0.01；与H/R+连翘苷低剂量组比较，3)P<0.01；与H/R+连翘苷中剂量组比较，4)P<0.01

2.4 APPL1过表达改善H/R心肌细胞应激和凋亡

与Con组比较，H/R组心肌细胞APPL1蛋白表达量(t=25.20，P<0.01)、SOD活性(t=19.28，P<0.01)、GSH-Px活性(t=25.50，P<0.01)、Bcl-2蛋白水平(t=18.34，P<0.01)明显降低，MDA含量(t=17.61，P<0.01)、凋亡率(t=21.78，P<0.01)、Bax蛋白水平(t=19.68，P<0.01)显著升高。H/R+pcDNA组与H/R组以上各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。与H/R+pcDNA组比较，H/R+pcDNA-APPL1组心肌细胞APPL1蛋白水平(t=17.83，P<0.01)、SOD活性(t=18.09，P<0.01)、GSH-Px活性(t=23.05，P<0.01)、Bcl-2蛋白水平(t=16.46，P<0.01)明显升高；MDA含量(t=12.92，P<0.01)、凋亡率(t=14.14，P<0.01)、Bax蛋白表达量(t=12.28，P<0.01)显著降低，但多数指标仍与Con组有较大差距。见图3和表4。

注：A， APPL1和凋亡相关蛋白电泳图(W-B)； B1-B4，相关各组细胞凋亡流式图图3 过表达APPL1对H/R心肌细胞凋亡的影响2.5 APPL1表达抑制逆转连翘苷对H/R心肌细胞保护作用

与H/R组比较，H/R+连翘苷组H/R心肌细胞APPL1蛋白表达量(t=19.04，P<0.01)、SOD水平(t=20.82，P<0.01)、GSH-Px水平(t=24.19，P<0.01)、Bcl-2蛋白表达量(t=17.89，P<0.01)明显升高，MDA含量(t=16.31，P<0.01)、凋亡率(t=18.26，P<0.01)、Bax蛋白表达量(t=15.36，P<0.01)显著降低。H/R+连翘苷+si-NC组与H/R+连翘苷组差异无统计学意义(P>0.05)。与H/R+连翘苷+si-NC组比较，H/R+连翘苷+si-APPL1组APPL1蛋白水平(t=12.08，P<0.01)、SOD活性(t=13.61，P<0.01)、GSH-Px活性(t=20.36，P<0.05)、Bcl-2蛋白水平(t=15.95，P<0.01)明显降低，MDA含量(t=10.69，P<0.01)、凋亡率(t=12.73，P<0.01)、Bax蛋白表达量(t=13.42，P<0.01)显著增加，呈现回复H/R组趋势。见图4和表5。

表4 APPL1过表达H/R心肌细胞应激和凋亡指标比较均=9)

注:与Con组比较，1)P<0.01；与H/R+pcDNA组比较，2)P<0.01

3 讨 论

I/R损伤与心脏手术、循环骤停或心肌缺血后不良、心血管预后相关[7]，细胞凋亡级联反应、氧化应激、线粒体功能障碍和炎症被认为是I/R诱导的心肌组织损伤的关键驱动因素[8]。已有研究表明，氧化应激会导致I/R损伤，氧化应激的生物标志物MDA、SOD和GSH-Px水平与细胞损伤的程度密切相关[9]。下调或抑制心肌细胞凋亡可以显著减少心肌I/R损伤[10]。本研究利用H/R模拟心肌细胞I/R损伤，发现H/R处理心肌细胞后，其氧化应激水平下降，凋亡蛋白水平和细胞凋亡率明显增加。

连翘是木犀科植物连翘的干燥果实，具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效[11]。中医认为，热毒损伤心脉，是心血管疾病的重要病机，清热解毒类中药可以通过改善心肌细胞的脂质过氧化损伤，或减少细胞的凋亡，从而发挥治疗心肌缺血的功效[12，13]。连翘苷是连翘主要活性成分之一，有抗菌、消炎、抗氧化、减肥、抗肿瘤等药理活性[14]。资料显示，连翘苷通过抑制肝细胞凋亡在乙醇诱导的肝细胞损伤中发挥保护作用[15]， 还可以有效保护H2O2导致的神经细胞株PC12氧化应激和细胞凋亡[16]，但连翘苷对心肌I/R损伤的作用尚未见诸报道。本研究应用连翘苷干预可明显降低H/R心肌细胞MDA含量、凋亡率和Bax蛋白表达，显著提高SOD、GSH-Px活性、Bcl-2蛋白水平，提示连翘苷干预H/R心肌细胞氧化应激损伤和细胞凋亡，保护心肌I/R损伤有重要价值。

注：A， APPL1和凋亡相关蛋白电泳图(W-B)；B1-B4，相关各组细胞凋亡流式图图4 抑制APPL1表达逆转连翘苷对H/R心肌细胞凋亡保护作用表5 抑制APPL1表达逆转连翘苷对H/R心肌细胞损伤的保护作用

注:与H/R组比较，1)P<0.01；与H/R+连翘苷+si-NC组比较，2)P<0.01

APPL1是多功能信号转导蛋白，可协调细胞内信号传导，调节细胞迁移和黏附等过程[17]。作为一种多功能适配蛋白，APPL1与多种疾病的发生和进展密切相关，如胃癌、糖尿病、心血管疾病等[18，19]。既往研究表明，脂联素显著抑制H/R损伤诱导的心肌细胞凋亡，与上调APPL1蛋白表达相关[20]；糖尿病治疗药物艾塞那肽通过上调APPL1表达，并抑制核转录因子-κB活性，改善了糖尿病心肌细胞凋亡和心脏功能[21]。本实验结果显示，H/R处理使心肌细胞中APPL1 mRNA和蛋白表达明显减少，采用连翘苷干预则明显提高APPL1 mRNA和蛋白水平，过表达APPL1能显著上调H/R心肌细胞SOD和GSH-Px活性，以及Bcl-2蛋白水平，并明显降低细胞凋亡率和Bax蛋白表达，而沉默APPL1可以逆转连翘苷抗H/R诱导的心肌细胞氧化应激和细胞凋亡，初步表明APPL1表达可能是连翘苷保护心肌细胞H/R损伤的重要途径和调节因素之一。

综上所述，连翘苷可以保护H/R诱导的心肌细胞H9C2氧化应激损伤，并减少细胞凋亡；其作用与调控APPL1表达有关。为连翘苷治疗心肌I/R损伤临床研究提供了参考。

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