miRNA-320及其靶基因内皮素-1与多囊卵巢综合征易感性及临床特点的关系研究

牟靖 谈宗国 吴萍

重庆三峡中心医院妇科，万州 404100

多囊卵巢综合征(PCOS)是女性最常见的生殖内分泌疾病，影响5%～10%的育龄妇女[1]。研究表明，PCOS患者存在代谢紊乱，表现为肥胖、2型糖尿病和胰岛素抵抗(IR)，约50%～70%的PCOS患者存在不同程度的IR[2]。越来越多的证据证实，PCOS患者IR和高雄激素血症之间存在关系[3]。miRNA-320具有广泛的生物学效应，可调节多种重要分子，尤其是内皮素。研究表明，miRNA-320的靶基因内皮素是内皮细胞产生的一种生物活性肽，可促进细胞有丝分裂，其中内皮素-1是最有效的生物分子，其合成和代谢失调与PCOS患者的IR密切相关[4]。PCOS发病机制中的遗传因素，特别是与该综合征病因有关的基因，以及环境因素在其表达中的作用，迄今尚未得到充分的研究[5]。本研究的目的是探讨miRNA-320作为PCOS的一种非侵袭性生物标志物的作用，并评价其与PCOS的IR及临床形态学特征的可能关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选择2017年4月—2019年4月重庆三峡中心医院妇科门诊就诊的75例为PCOS患者研究组，再根据稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)分为非IR-PCOS组(HOMA-IR≤2.11，n=40)和IR-PCOS组(HOMA-IR>2.11，n=35)，选择同期门诊就诊的健康女性40名为对照组。PCOS组平均年龄为(31.95±7.42)岁，对照组平均年龄为(32.38±7.68)岁。PCOS的诊断依据2014英国皇家妇产科医师学院PCOS的远期影响指南(NO.33)[6]。排除雄激素过多症状史(如非经典先天性肾上腺皮质增生、雄激素分泌肿瘤、库欣综合征、21-羟化酶缺乏症或高催乳素血症)、高血压、肝、肾或甲状腺疾病等。本研究经医院伦理委员会批准[批准文号：2017年科研第(023)号]，所有患者均同意参加研究并签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 实验室及超声检查 血液样本取自受试者在月经周期的早期卵泡期禁食过夜后的血液样本。采用自动生化分析仪(Roche Cobas 8000-c702，Roche Diagnostics，德国)测定空腹血浆葡萄糖、总胆固醇、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、甘油三酯和低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)水平。通过阴道超声评估卵巢体积和窦卵泡计数。

1.2.2 多毛症评分 采用多毛症Ferriman-Gallwey评分标准评估多毛症得分，1级为1分，2级为2分，3级为3分。总分小于6分为正常；总分6～9分提示毛发过多；总分大于9分为多毛。

1.2.3 ELISA 采用ELISA试剂盒测定血清内皮素-1、空腹血清胰岛素、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、总睾酮。HOMA-IR=空腹胰岛素(mIU/L)×空腹血糖(mg/dl)/22.5，稳态模型评估-β细胞功能指数(HOMA-β)=20×空腹胰岛素(mIU/L)/[空腹血糖(mmol/L)-3.5][7]。

1.2.4 RT-PCR 采用miRNeasy mini试剂盒(Qiagen，德国)从血清样品中提取miRNA-320，采用Qubit 3 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)测定miRNA的浓度和纯度，采用miScript Ⅱ RT试剂盒(Qiagen，德国)进行逆转录反应。采用Stratagene Mx3005P平台(Agilent Technologies，USA)和Quanti Fast SYBR Green PCR Kit(Qiagen，德国)进行扩增。引物由上海生工生物有限公司设计合成U6 snRNA作为对照(表1)。总体积为20 μl反应体系，其中10 μl Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix，2 μl正向引物，2 μl反向引物，4 μl无RNA酶水和2 μl cDNA。循环条件：95℃初始活化15 min，然后在94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共40个循环。获得表达值作为相对基因(ΔCT=靶基因CT-参考基因CT)。

2 结果

2.1 PCOS组与对照组的临床和实验室特征比较IR-PCOS组体重指数、空腹胰岛素、HOMA-IR、雄烯二酮水平较对照组和非IR-PCOS组显著升高(P均<0.05)，HOMA-β较对照组和非IR-PCOS组显著降低(P均<0.05)。与对照组相比，IR-PCOS组和非IR-PCOS组卵巢体积、窦卵泡计数、甘油三酯、总胆固醇、LDL-C水平显著升高(P均<0.05)，HDL-C水平显著降低(P<0.05)，见表2。

表1 miRNA-320和U6 snRNA基因PCR引物和扩增产物

表2 PCOS组与对照组的临床和实验室特征比较

注：PCOS：多囊卵巢综合征；BMI：体重指数；LDL-C：低密度脂蛋白-胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-胆固醇；HOMA-IR：稳态模型评估-胰岛素抵抗指数；HOMA-β：稳态模型评估-β细胞功能指数；FSH：卵泡刺激素；LH：黄体生成素；与对照组相比，aP<0.05；与非IR-PCOS组相比，bP<0.05；1 mmHg= 0.133 kPa

2.2 PCOS组与对照组血清miRNA-320及内皮素-1水平比较 与对照组相比，PCOS组血清miRNA-320表达水平显著降低(t=3.17，P=0.019)，血清内皮素-1水平显著升高(t=-5.483，P=0.002)，见图1。与非IR-PCOS组相比，IR-PCOS组血清miRNA-320表达水平显著降低(t=-2.864，P=0.029)，血清内皮素-1水平显著升高(t=2.513，P=0.048)，见图2。

2.3 PCOS患者血清miRNA-320表达水平与临床和生化指标的相关性分析Pearson相关性分析显示，PCOS组血清miRNA-320表达水平与多毛症得分、卵巢体积、窦卵泡计数、甘油三酯、空腹胰岛素、HOMA-IR、LH等呈负相关(P均<0.05)，与HOMA-β呈正相关(P<0.05)，见表3。

2.4 PCOS患者血清miRNA-320水平影响因素的线性回归分析及logistic回归分析 线性回归显示，多毛症得分和HOMA-IR是PCOS患者血清miRNA-320水平的主要影响因素，见表4。Logistic回归结果显示，miRNA-320表达水平是PCOS的独立危险因素，见表5。

2.5 血清miRNA-320、内皮素-1水平预测PCOS的准确性 采用受试者工作特征曲线评价血清miRNA-320表达水平对PCOS的诊断能力，曲线下面积为0.816(95%CI： 0.788～0.935,P<0.001)，敏感性为80%，特异性为97.5%，最佳截点为0.743，见图3。血清内皮素-1水平对PCOS的诊断能力，曲线下面积为0.822(95%CI： 0.804～0.959,P<0.001)，敏感性为91.7%，特异性为99.3%，最佳截点为5.66 ng/L，见图4。

表3 PCOS患者血清miRNA-320表达水平与临床和生化指标的相关性分析

注：PCOS：多囊卵巢综合征；BMI：体重指数；LDL-C：低密度脂蛋白-胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-胆固醇；HOMA-IR：稳态模型评估-胰岛素抵抗指数；HOMA-β：稳态模型评估-β细胞功能指数；FSH：卵泡刺激素；LH：黄体生成素

表4 PCOS患者血清miRNA-320水平影响因素的线性回归分析

注：PCOS：多囊卵巢综合征；BMI：体重指数；HOMA-IR：稳态模型评估-胰岛素抵抗指数

表5 PCOS患者危险因素的logistic回归分析

注：PCOS：多囊卵巢综合征；BMI：体重指数； LH：黄体生成素

3 讨论

PCOS是一种以高雄激素血症和IR为特征的复杂异质性内分泌疾病。在非排卵期妇女的多囊卵巢中，调节窦卵泡发育的精确分子机制尚不清楚，但这些卵泡的生长通常在成熟卵泡预期排卵前停止[8]。研究表明，miRNAs在PCOS女性的卵泡发育和类固醇生成中起关键作用[9]。由于血清miRNAs稳定，对核酸酶活性具有抗性并且易于检测，可能作为PCOS的非侵入性生物标志物。

本研究发现，与对照组相比，PCOS组存在IR、血脂异常以及PCOS表型特征显著异常。PCOS组血清miRNA-320表达水平显著降低，IR-PCOS组miRNA-320表达水平显著低于非IR-PCOS组，IR-PCOS组空腹胰岛素、HOMA-IR水平较对照组和非IR-PCOS组显著升高，HOMA-β较对照组和非IR-PCOS组显著降低。Massart等[10]研究发现，糖尿病个体血清和糖尿病啮齿类动物心脏微血管细胞中miRNA的水平下降。Lv等[11]研究发现，miRNA-320在高血糖患者中的表达降低，且miRNA-320可通过细胞外信号调节蛋白激酶1/2负调控内皮素-1、血管内皮生长因子和纤黏连蛋白的表达。刘凯鲁等[12]研究发现，miRNA-320在PCOS患者卵泡液中的表达水平明显低于健康对照组。Li等[13]研究证实，与健康对照组相比，IR-PCOS组卵巢组织中miRNA-320表达下调，且miRNA-320可以通过胰岛素受体底物-1调节细胞外信号调节蛋白激酶1/2信号通路抑制IR。此外，Constantin等[14]研究表明，在卵巢发育过程中，miRNA-320在颗粒细胞中的表达水平升高，并与卵巢滤泡增殖和类固醇生成相关。

本研究发现，PCOS组血清内皮素-1水平明显高于对照组。Anggorowati等[15]也报道，与年龄匹配的对照组相比，PCOS患者内皮素-1水平更高。与非IR-PCOS组相比，IR-PCOS组血清内皮素-1水平显著升高。内皮素-1是反映血管内皮功能的早期预测指标，而血管内皮功能紊乱是心血管疾病、糖尿病及代谢综合征的“中心环节”[15]。内皮素-1受不同基因表达水平的调控，尤其是miRNA在转录后水平的调控，miRNAs可以通过直接靶向mRNA并抑制其转化为蛋白质，和(或)通过干扰表观基因组，调节正常和疾病状态下的基因表达[16]。此外，miRNA-320表达水平与PCOS独立相关，其预测PCOS的特异性较高。

PCOS患者血清miRNA-320表达水平显著降低，并负反馈调节内皮素-1的水平。miRNA-320与PCOS患者多毛症得分、卵巢体积、窦卵泡计数、甘油三酯、空腹胰岛素、HOMA-IR、HOMA-β、LH等呈负相关，诊断PCOS的特异性高，可作为PCOS的无创诊断生物标志物。