核转录因子-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷对急性一氧化碳中毒大鼠模型中iNOS动态变化的影响

蒋力 雷蕊绮 彭红艳 辜刚凤 李经伦

西南医科大学附属医院神经内科（四川泸州646000）

过量的一氧化碳（CO）气体被人体吸入，往往造成患者无意识的中毒，从而引起一系列严重的心脑肺等临床症状。患者表现出以意识障碍、头痛、恶心、呼吸困难等症状，尤以脑部较为严重［1-2］。在临床上积极治疗恢复意识后，约10% ～30%的患者容易出现短暂的假愈期，后出现以痴呆、锥体外系及精神症状等为主的神经系统症状，称之为急性一氧化碳中毒迟发性脑病（delayed encephalophathy after acute carbon monoxidepoisoning，DEACMP）［3-5］。关于DEACMP的发生原因，目前研究认为主要与缺氧缺血、氧化应激、炎症与免疫、细胞凋亡等有关［6］。由于血红蛋白与CO结合生成碳氧血红蛋白，造成组织缺氧导致炎症免疫反应［7-8］，既往研究表明iNOS是炎症免疫反应主要的限速酶，能诱导生成大量NO，从而介导神经细胞凋亡［9-10］。本实验通过改良腹腔注射法建立CO大鼠中毒模型，使用二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）进行干预NF-κB的激活，观察大鼠海马区细胞凋亡及脑组织NF-κB、iNOS表达变化情况，从而探讨NF-κB/iNOS 信号通路在DEACMP 发病中可能存在的作用，同时为DEACMP治疗提供一定的实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料250 g 左右SD 雄性大鼠（由西南医科大学动物中心提供），99.99%高纯度CO 气体（由泸州西南化工研究所制备）；二硫代氨基甲酸吡咯烷（sigma 公司，美国）；Morris 水迷宫（西南医科大学中心实验室提供）等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组将120 只成年健康雄性SD 大鼠（280～300 g，SPF 级）随机分成3 组：空气组（AC 组）、CO 中毒组（CO 组）、PDTC + CO 中毒组（PD 组），每组40 只，每组大鼠按染毒后第1、3、7、14、21 天分为5 个小组。

1.2.2 动物模型制作采用改良式腹腔注射CO 法制备大鼠DEACMP模型［11］，其中CO组、PD组按首次剂量100 mL/kg 进行CO 腹腔注射，每间隔4 h 追加一次，追加剂量为首次剂量的一半（即50 mL/kg），共追加3 次，AC 组用等量空气进行腹腔注射，PD组在造模前1 h 腹腔注射PDTC（100 mg/kg），造模后每天注射1 次，直至处死。

1.2.3 尾尖血COHB 含量测定和Morris 水迷宫实验在CO 组和PD 组中各随机抽取1 只老鼠，分别在造模后0.25、0.5、2、4、8、12、16 h 股动脉采血1 mL，全自动血气分析仪测定HbCO 浓度。观察大鼠染毒后发生的变化，用Morris 水迷宫检测大鼠学习记忆能力变化情况。

1.2.4 取材将各时间点对3 组大鼠取材，每组大鼠取一半断头于冰面上剥离出脑组织，分离出整个海马，置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于Western blot 实验。余下大鼠使用10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，行生理盐水心脏灌洗和4%多聚甲醛固定，取脑组织制作组织切片。

1.2.5 HE 染色观察脑组织形态常规石蜡包埋、切片，予以脱蜡，然后用乙醇脱水，行HE 染色，光镜下观察海马CA1 区细胞形态学变化。

1.2.6 Western Blot检测NF-κB、iNOS的表达将低温保存的海马组织分离成小块置于匀浆器匀浆，超声裂解组织，离心后测定蛋白浓度，SDSPAGE 凝胶电泳，经过转膜、封闭、抗体孵育后，用Western Blot 发光检测试剂盒显影、定影，凝胶成像系统采集图像，最后进行分析。

1.2.7 免疫荧光检测NF-kB、iNOS 的表达石蜡切片经过脱蜡、梯度乙醇脱水后，放置于PBS缓冲液中漂洗，然后再置于EDTA 缓冲液中微波修复，经BSA封闭。加入一抗、二抗，DAPI染液，漂洗后用抗荧光淬灭剂封片，及时在免疫荧光显微镜下观察。

1.2.8 细胞凋亡检测常规进行脱蜡水化，采用高温抗原修复，阻断内源性过氧化物酶活性，给予TUNEL 反应液发生酶标反应，DAB 显色，封片后观察，计算凋亡指数进行统计分析。

1.3 统计学方法使用SPSS 22.0 统计软件对数据进行处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较使用单因素方差分析，多重比较采用SNK-q检验。组内不同时间点比较采用重复测量方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模成功注射首剂CO时，大鼠约5 min后开始出现躁动、呼吸急促，部分大鼠皮肤黏膜呈现樱桃红色，首次追加大鼠出现瘫软、动作迟缓，继续追加，出现肢体强直抽搐甚至昏迷，将其放至流动通风处，意识逐渐恢复，极少数大鼠死亡（病死率7/168），随即补充相应数目的大鼠。及时解剖死亡大鼠，发现其血色暗红，腹腔脏器及脑组织充血水肿。

2.2 Morris 水迷宫实验结果水迷宫结果显示染毒前及染毒后7 d 内3 组大鼠平均逃避潜伏期、穿越平台次数、平台运动总时间相比较无统计学差异（P＞0.05），染毒后第14～28 天CO 组大鼠较AC组和PD 组相比平均潜伏期显著延长（P＜0.05），大鼠平台所在象限运动时间、穿越平台次数明显减少，CO 组与AC 和PD 组比较差异具有统计学意义（P＜0.05），AC 组与PD 组相比，其差异也具有统计学意义（P＜0.05）。见图1、2、3。

图1 各时间点平均逃避潜伏期比较Fig.1 Comparison of average escape latency at each time points

2.3 动脉血HbCO 浓度变化各组大鼠染毒前尾血COHB 浓度均值始终低于5%，CO 组和PD 组在染毒约30 min 后取尾尖血测定碳氧血红蛋白饱和度均值为65% 以上，行第1 次追加CO 时大鼠体内HbCO 浓度仍＞50% 以上，间隔注射CO 可使大鼠体内HbCO＞50%持续16 h 以上。

图2 各时间点穿越平台次数比较Fig.2 Comparison of the number through the platform at each time points

图3 各时间点平台所在象限运动时间比较Fig.3 Comparison of motion time in the platform at each time points

2.4 HE 染色HE 染色结果显示CO 组大鼠海马CA1 区神经元细胞呈核固缩性，胞内间隙增大，胞质与胞核显示不清，细胞排列杂乱，可见坏死神经细胞被吸收后留下的龛影。AC 组大鼠海马CA1区神经元排列整齐紧密，核膜完整，核仁清晰。PD 组大鼠海马CA1 区神经元细胞因受到PDTC 干预的保护，其形态介于两者之间。见图4。

图4 第14 天各组海马CA1 区HE 染色（×400）Fig.4 HE staining in CA1 area of hippocampus in each group on the 14th day（×400）

2.5 Western Blot 检测结果CO 组大鼠海马CA1区NF-kB 于3 d 时表达明显，随着时间推移逐渐增加；iNOS 表达于第3 天达到高峰，后逐渐减少。AC 组NF-kB、iNOS 仅有少量表达。PD 组NF-kB 及iNOS 表达相对CO 组减少，且各时间点差异显著（P＜0.05）。见图5 和表1。

2.6 免疫荧光结果AC 组大鼠海马CA1 区NF-kB、iNOS 仅有少量表达，且无动态变化，CO 组NFκB 的表达于染毒后增加（1 d），于3 d 时快速增高，后缓慢增高；iNOS 的表达于染毒后先增加，于3 d时达到峰值，后逐渐降低。PD 组各时间点NF-κB及iNOS 的表达均较CO 组降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、2 和图8、9。

图5 海马CA1 区NF-κB、iNOS 蛋白免疫印迹法结果Fig.5 results of NF-κB，iNOS protein Western imprinting in hippocampal CA1 region

图6 NFκB p65/GAPDH 的灰度比值Fig.6 The gradation ratio between NF-κB p65 and GAPDH

图7 iNOS/GAPDH 的灰度比值Fig.7 The gradation ratio between iNOS and GAPDH

2.7 Tunel 法检测细胞凋亡情况AC 组大鼠海马CA1 区各时间点仅可见极少量凋亡细胞，CO组、PD 组凋亡细胞随染毒时间延长而明显增多，PD 组各时间点凋亡细胞计数均明显少于AC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图10。

3 讨论

急性CO 中毒是常见的气体中毒，因其可导致DEACMP 而备受临床重视，其发病机制目前尚未明了，随着炎症免疫反应在疾病发病机制中受到重视，NF-kB/iNOS 信号通路是否参与DEACMP 的发病及其相关调控也受到关注，一氧化氮（NO）是体内一种重要的信号传递分子，在炎症免疫反应等生理及病理中发挥重要作用［12-13］。生理量的NO 可以促进递质释放，在大脑学习与记忆的活动中发挥作用，同时可以调节脑部的血流供应情况，保护性神经免疫防御功能，而过量的NO 表达能介导神经细胞死亡。NO 是由三种不同基因编码的一氧化氮合酶合成的：神经元型NOS（nNOS），诱导型NOS（iNOS）及内皮型NOS（eNOS）。nNOS 和eNOS 的表达受到转录、转录后（包括RNA）及翻译后机制（包括磷酸化、ACE）的高度调控，在生理状态下eNOS 和nNOS 在体内均有表达。相反，在促炎和氧化应激条件下，iNOS 主要通过基因转录调控，其在病理损害状态下诱导表达催化生成大量NO，随着NO 在体内浓度的蓄集，过量的NO 会介导神经细胞死亡［14-15］。iNOS 是催化合成NO 的关键酶，其广泛分布在神经元及脑血管内皮细胞中［16-17］。其受核转录因子（NF-κB）调控，是下游调控表达重要的炎症反应因子，NF-κB 在体内参与了各种促炎因子、趋化因子等相关下游因子的转录和调控。炎症缺氧等病理生理过程能使NFκB 激活，活化的NF-κB 与细胞核内iNOS 基因结合位点相结合，诱导iNOSmRNA 转录和表达，进而催化精氨基酸和氧产生大量NO，对大鼠神经细胞造成损伤。

表1 各组大鼠不同时间点NF-κB 免疫荧光吸光度比较Tab.1 Comparison of NF-κB immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

表1 各组大鼠不同时间点NF-κB 免疫荧光吸光度比较Tab.1 Comparison of NF-κB immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

注：与AC 组比较，#P＜0.05，与CO 组比较，*P＜0.05

分组AC 组CO 组PD 组例数8 8 8第1 天2 104.48±201.01 6 139.64±925.88#4 175.19±256.54#*第3 天2 026.19±109.13 8 984.53±632.63#6 940.85±592.07#*第7 天2 103.31±169.09 9 442.42±853.91#6 117.02±720.02#*第14 天2 156.21±142.40 10 589.90±921.16#5 460.19±415.81#*第21 天2 077.85±115.80 11 211.01±1 097.36#5 066.95±347.27#*

表2 各组大鼠不同时间点iNOS 免疫荧光吸光度比较Tab.2 Comparison of iNOS immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

表2 各组大鼠不同时间点iNOS 免疫荧光吸光度比较Tab.2 Comparison of iNOS immunofluorescence absorbance at different time points in each group ±s>

注：与AC 组比较，#P＜0.05，与CO 组比较，*P＜0.05

分组AC 组CO 组PD 组例数8 8 8第1 天1 521.64±236.50 4 912.37±349.54#3 179.39±569.33#*第3 天1 576.23±195.92 8 370.01±598.79#5 447.16±477.07#*第7 天1 513.63±151.08 7 219.01±342.71#4 981.73±399.28#*第14 天1 622.26±144.98 6 585.77±595.67#4 380.33±688.84#*第21 天1 513.33±142.52 6 113.04±588.87#3 613.89±612.82#*

图8 第14 天各组海马CA1 区NF-κB 的表达Fig.8 Expression of NF-κB in hippocampal CA1 region of each group on the 14th day

图9 第14 天各组海马CA1 区iNOS 的表达Fig.9 Expression of iNOS in hippocampal CA1 region of each group on the 14th day

图10 各组大鼠不同时间点凋亡细胞数比较Fig.10 Comparison of the number of apoptotic cells in each group at different time points

本实验通过改良腹腔注射法复制CO 中毒大鼠模型，相比自然吸入CO 其染毒程度更易控制，能够动态监测血中COHB 浓度，大鼠动脉血COHB实验结果也证实，间隔腹腔注射法能使大鼠体内动脉血HbCO＞50%持续16 h 以上，笔者前期动物实验也证实此造模方法安全有效，是理想的造模方法。通过Morris 水迷宫检测大鼠空间学习及记忆的能力，其结果显示染毒后7 d 各组间平均潜伏期时间比较差异无统计学意义（P＞0.05），染毒后14 d 组间差异有统计学意义（P＜0.05），其时间节点上提示与临床上迟发性脑病发病时间基本相符，再者通过证实造模成功。

既往研究表明海马CA1 区对一氧化碳中毒等损伤最为敏感，也被称为易损区［18-19］，所以本研究通过测定大鼠海马CA1 区NF-κB 及iNOS 蛋白免疫印迹法结果显示，在AC 组中仅可检测到少量表达，CO 组染毒后第3 天海马CA1 区NF-κB 表达明显增多，随着时间的推移呈现逐渐增加的过程，iNOS 的表达在染毒后第3 天达到高峰，而后逐渐减少。通过Morris 水迷宫测定大鼠学习及记忆变化结果提示，AC 组、CO 组及PD 组大鼠在染毒后前7 d 各项指标差异无统计学意义（P＞0.05），提示此时尚未发生迟发性脑病，与临床上的假愈期时间基本一致，分析可能与染毒前期NF-κB 激活，转录iNOS 的表达催化合成NO，发挥了神经保护作用有关，随着时间的推移，NO 的持续过量合成，在体内蓄积浓度的增加，发挥了持续的神经损害作用，介导神经元细胞凋亡，这也能进一步解释CO 中毒前期未对大鼠造成严重的学习记忆能力损害，而随时时间推移，损害进一步加重，从而发生了迟发性脑病的原因。

PDTC 是NF-κB 的特异性抑制剂，可以减少其表达［20-21］。本实验使用PDTC 干预NF-κB 的表达后发现，PD 组NF-κB 的表达明显减少，与CO 组相比组间差异明显，具有统计学意义（P＜0.05），证实PDTC 可以抑制NF-kB 的表达，与既往文献报道一致［22］。与此同时，iNOS在PD组的表达与CO组相比，也表现出减少的趋势，所以笔者得出结论，NF-κB、iNOS 参与了DEACMP 的发生过程，且通过HE 染色观察发现，使用PDTC 干预后，可以有效的减轻海马区神经细胞的组织损害，分析其原因可能是因为NF-κB 的表达减少，使得iNOS 的转录调控受到限制，从而使得NO 的合成表达较少，使神经细胞的损伤减轻，进而表现在大鼠记忆及行为改变相比CO 组的改变轻。

综上所述，笔者认为NF-κB/iNOS 信号通路参与了DEACMP 的发病过程，且扮演着重要作用，PDTC 的干预通过下调NF-κB 的激活及减少iNOS的表达，从而减轻大鼠神经细胞的损伤，morris 水迷宫行为学检测也证实PD 组行为学改变较CO 组更轻，PDTC 的干预是否可以成为临床上治疗该疾病一种的方法还需要大量的研究来证实，也期待未来进一步的研究来证实。