炎症小体Nlrp3通路激活在尿毒症心肌病模型小鼠左心室重构的作用

文俪桦 傅强 严全能 李晚泉 贺不凡 Gael Akindavyi 李志樑

1南方医科大学珠江医院心内科（广州510280）；2南方医科大学深圳医院心内科（广东深圳518101）；3佛山市三水区人民医院（广东佛山3528100）

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者终末期的最主要死亡原因是心血管疾病，而尿毒症心肌病是其中重要的组成部分，是晚期CKD患者较为常见的一种并发症，有研究表明3期以上的CKD患者普遍伴发心肌疾病，尿毒症期甚至高达75%[1-2]。尿毒症心肌病特征是左心室肥大、舒张功能障碍和心肌张力受损，可导致充血性心力衰竭、心肌缺血、心律失常，甚至猝死，从而大幅增加CKD患者的心血管病死率[3]。

左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）是尿毒症心肌病最主要的特征型病理改变，已有研究指出LVH的主要机制与慢性肾衰导致高血压和容量负荷增加有关，但在临床工作中有效的血压和容量负荷控制仍不能完全阻止尿毒症心肌病的持续进展[1]。近年许多研究者把目光放在尿毒症患者的内环境改变和心血管并发症之间的关系上。由于肾功能减退可造成尿毒症患者体内大量毒素蓄积，其中许多毒素，如硫酸吲哚酚（IS）、对甲酚硫酸盐等蛋白结合毒素，而且常规透析不能将它们有效消除。临床研究已证实IS与尿毒症时心血管疾病的发生有着密切联系[4]。

IS 可以刺激细胞炎症反应，生成大量炎症因子，存在于血循环中，对心血管系统产生严重危害[5-6]。炎症是宿主对体内病原体产生的防御反应，而肾脏发炎不仅对病原体反应，还对一些无菌刺激，如缺血、高糖环境的反应[7-8]。细胞质核苷酸结合寡聚化域样受体蛋白3（Nlrp3）与凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和caspase-1的凋亡相关斑点样蛋白形成炎性小体，随后激活caspase-1，最终激活IL-1β和IL-18，并诱导免疫细胞中的磷酸化[9-11]。Nlrp3 炎性小体与多种肾脏疾病有关，包括急性肾脏损伤（AKI）和CKD[12]。肾脏病中Nlrp3 激活加剧了炎症和纤维化，免疫细胞或与肾非免疫细胞作用可通过Nlrp3 炎性小体的炎症反应来介导肾脏疾病的进展[13]。目前大多研究表明Nlrp3 炎性小体的激活可通过NF-κB 途径被其他毒素和炎症因子快速激活[4，14]。尿毒症心肌病的作用机制较复杂，而尿毒症毒素IS和Nlrp3 炎性小体是否参与尿毒症心肌病的LVH 形成并起重要作用尚未明确，本实验通过建立尿毒症心肌病小鼠模型探讨IS 诱导LVH的作用以及验证其与Nlrp3 炎性小体有关的相关作用机制，以期能为尿毒症心肌病提供新的治疗思路和治疗策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及饲养条件2019年3-9月选取8周龄SPF级的C57BL/6J 小鼠20只，体质量（20±2）g，由南方医科大学动物实验中心提供[许可证号SCXK（粵）2011-0015]。饲养条件为恒温环境（20±2）℃及相对湿度控制在（50±5）%，24 h 自由摄入鼠粮及水，每日人工照明各12 h，昼夜循环。

1.1.2 实验试剂及仪器全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技，型号Chemray 240），倒置相差显微镜（Leica，Germany），酶标仪（Thermo，型号Varioskan LUX），心脏超声仪（Vevo 2100 Imaging System），微量离心机（Thermo，型号LEGEND Micro21R），冷光源动物手术灯（瑞沃德生命科技，型号76301），倒置显微镜（Leica，型号DMI1）。

小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）购于广州吉妮欧生物科技有限公司，戊巴比妥钠购于Sigma公司，肌酐测定试剂盒购于Pythonbio公司，BCA 蛋白浓度检测试剂盒购于Thermo公司，BNP、1β抗体购于万类公司，Nlrp3、ANP、Pro-caspase1 购于abcam公司，P65 购于博奥森公司，Phospho-P65 购于CST公司，HE 染液购于索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组采用随机数字表法将小鼠分成假手术组（10只）、模型组（10只）。假手术组将与模型组一同进行腹腔手术，但不对肾脏进行切除。模型组制备的是5/6 肾切尿毒症心肌病小鼠模型。造模8周时，将对所有小鼠进行超声心动图检测各组小鼠心脏收缩及舒张功能，然后处死（采用断颈术），分别收集各小鼠的血液及心脏标本。

1.2.2 5/6肾切尿毒症心肌病小鼠模型的制备使用腹腔注射10%戊巴比妥钠（150 μL）对小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠采用俯卧位固定于手术台上，小鼠背部的手术区域首先使用剃毛器剃除背部毛发，手术区域皮肤用0.5% 洗必泰溶液消毒。采用背部左侧切口剪开皮肤开腹暴露左肾，然后分离肾上腺及肾周脂肪，将左肾游离。直接用眼科剪避开肾门处剪除上下两级（约各占肾脏体积1/3）后，同时使用明胶海绵压迫切口处止血2～3 min，直至不出血或极少量出血时将残肾复位至肾窝，并将原位的脏器及腹膜覆盖其上方，使用逐层间断缝合腹膜和皮肤，缝合结束后酒精消毒手术区域伤口皮肤。1 周后，以相同的方法暴露及游离右侧肾脏，在肾门处结扎右肾动静脉及输尿管后，切除右肾。假手术组则只对小鼠进行开腹处理，而不做肾切。以上手术操作均严格遵循无菌操作原则并在无菌条件下进行[15]。

1.2.3 心脏彩超检测在肾切后8周，小鼠吸入异氟烷气体进行麻醉，采用超声心动图（Vevo 2100 Imaging System）对其进行检查，记录检测的项目包括左心室内径（LVESD、LVEDD）、左心室前后壁厚度（LVAWD、LVAWS、LVAWD、LVAWS）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室射血分数（EF）、心输出量（CO）、左心室等容舒张时间（IVRT）、E/A、心肌活动指数（MPI）、LVFS/MPI，其中MPI和LVFS/MPI可反映心肌受损的程度[16]。

1.2.4 生化指标检测造模8周后，处死，收集血液标本，放入肝素化1.5 mL EP 管中充分混匀，离心（4℃，8 000 r/min，6 min），取上清液后于-80℃冰箱保存。采用全自动生化分析仪检测血肌酐和尿素氮水平。采用高效液相色谱法检测血浆IS水平，上述操作步骤均严格按照仪器及试剂盒说明书具体操作步骤和注意事项进行，用酶标仪测出吸光度，再按照各说明书上对应的计算公式将样本吸光度换算成浓度。

1.2.5 心脏HE染色造模8周后，将小鼠处死，收集心脏及血液标本后，从两组中各随机挑选5个心脏标本，用4%多聚甲醛固定24 h 后，脱水、石蜡包埋、切片，然后按标准操作步骤进行HE染色，光学显微镜下观察两组小鼠心肌细胞的核排列及大小情况。

1.2.6 Western blot从两组小鼠中各随机挑选5个心脏标本，分别采集心肌组织50 μg，加入306 μL RIPA 裂解液（300 μL RIPA+3 μL 磷酸酶抑制剂+3 μL 蛋白酶抑制剂），超声破碎，12 000×g，4℃离心15 min，使用BCA 试剂盒测定总蛋白浓度。根据所测的蛋白浓度，加入RIPA、lodding buffer 将蛋白稀释至5 mg/L。每例标本取总蛋白30 μg，进行SDS-PAGE 电泳（80 V 30 min，110 V 80 min），随后以恒压100 V 电转至PVDF 膜上，封闭液（1×TBS，5% 脱脂奶粉）室温封闭2 h，分别孵育一抗（anti-ANP、anti-BNP、anti-Nlrp3、anti-Pro-caspase1、anti-1β、anti-P65、anti-Phospho-P65），4℃振摇过夜。第2 天洗膜（每次10 min，共3次），室温孵育二抗（1∶8 000）2 h，洗膜（每次10 min，共3次），加ECL 发光剂曝光，并记录结果。蛋白相对表达量经内参GAPDH 校正后使用Image J 软件分析条带。

1.2.7 细胞培养复苏RAW264.7 细胞并转移到100 mm的细胞培养皿中，加入含10%胎牛血清的1640 培养基，放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。待细胞长满一皿后传代接种至60 mm的培养皿中，分为对照组和IS组。24 h 细胞贴壁后，更换含1%胎牛血清的培养基饥饿8～10 h，IS组给予IS（15 μmol/dL）刺激3 h，提取各组细胞蛋白。

1.3 统计学方法用SPSS 22.0 统计软件对数据进行分析，结果用均数±标准差的形式表示，两组间若呈正态分布，使用独立样本t检验，非正态分布则采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血浆IS水平与尿毒症心肌病小鼠心室肥厚的关系

2.1.1 尿毒症心肌病小鼠模型建立和血浆IS水平在对小鼠进行5/6肾切8周后，检测两组小鼠的血浆，发现与假手术组相比Scr、BUN 明显升高，且均升高2倍以上（P＜0.05），故构建尿毒症小鼠模型成功。此外，检测两组血浆IS水平，发现模型组小鼠血浆IS 较假手术组显著升高（P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠生化结果比较Tab.1 Comparison of biochemical outcomes in different groups±s

表1 各组大鼠生化结果比较Tab.1 Comparison of biochemical outcomes in different groups±s

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

指标Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）IS（mg/L）假手术组11.66±2.70 20.92±2.01 3.37±1.22模型组27.82±14.68**52.16±26.09*5.80±1.99**

2.1.2 心脏彩超收缩功能的比较超声心动图检测结果显示，在长轴和短轴的M型超声上，模型组较假手术组相比心腔有不同程度的缩小。两组比较，LVAWd和LVPWd 均增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型组小鼠的EF和短轴缩短率（FS）较假手术组显著降低（P＜0.01）。而LVESd、LVEDd、LVAWs、LVPWs、CO 指标差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.1.3 心脏彩超舒张功能的比较心脏超声心动图结果示：左心室等容舒张时间（IVRT）、E/A、心肌活力指数（MPI）均较假手术组小鼠有所升高，但只有MPI 差异具有统计学意义（P＜0.05）。模型组小鼠LVFS/MPI 均较假手术组显著下降，且差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2和图1。

2.1.4 心脏组织HE染色、ANP、BNP蛋白表达情况HE染色结果显示，与假手术组相比，模型组小鼠的心肌细胞心肌纤维排列较为紊乱，高倍镜下可观察到心肌细胞肥大，横纹粗糙，细胞核紊乱，见图2。与假手术组相比，模型组心肌组织ANP、BNP表达均明显上调（P＜0.05），其中以ANP表达上调最为显著。见图3。

2.2 Nlrp3与尿毒症心肌病小鼠心室肥厚的关系

2.2.1 心脏组织Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β、p-P65 蛋白表达情况与假手术组相比，模型组小鼠心脏组织Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β表达均显著升高（P＜0.05），其中以Pro-caspase1、IL-1β上调幅度最为明显（P＜0.01），超过2倍。进一步检测了p-P65、P65 蛋白表达情况，结果显示，模型组p-P65蛋白表达较假手术组明显上升（P＜0.05），见图3。

表2 假手术组和模型组小鼠心脏超声左心室收缩功能和舒张功能结果比较Tab.2 Comparison of echocardiography ofleft ventricular systolic functionparametersat between model with sham group±s

表2 假手术组和模型组小鼠心脏超声左心室收缩功能和舒张功能结果比较Tab.2 Comparison of echocardiography ofleft ventricular systolic functionparametersat between model with sham group±s

注：与假手术组相比，*P＜0.05，**P＜0.01

指标LVESd（mm）LVEDd（mm）LVAWs（mm）LVAWd（mm）LVPWs（mm）LVPWd（mm）CO（mL/min）EF（%）FS（%）IVRT（ms）MPI E/A LVFS/MPI假手术组2.29±0.69 4.14±1.00 1.33±0.18 0.83±0.02 1.28±0.18 0.69±0.10 22.07±5.34 77.55±9.36 46.58±9.22 8.91±2.09 0.28±0.02 1.46±1.18 182.25±55.53模型组2.87±0.62 4.33±0.64 1.47±0.31 1.02±0.20*1.23±0.12 0.79±0.03*27.08±8.98 62.99±9.11**34.17±6.33**12.61±3.09 0.41±0.08*1.35±0.24 108.50±45.18*

2.2.2 IS刺激巨噬细胞后Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β、p-P65蛋白表达情况在细胞实验中发现，与对照组相比，IS组的巨噬细胞蛋白合成速率显著上升，且Nlrp3、Pro-caspase1、IL-1β表达亦明显上调（P＜0.05）。由此说明IS 可促使巨噬细胞分泌炎症因子IL-1β和诱导Nlrp3、Pro-caspase1 蛋白表达。进一步实验检测发现，IS组巨噬细胞的p-P65表达均较对照组升高（P＜0.05），见图4。

3 讨论

图1 假手术组和模型组小鼠心脏超声图像Fig.1 Echocardiographic presentation in differentgroups

在所有尿毒症并发症的死亡原因中，心血管因素约占半数，而且其死亡率是正常人群的30倍[17]。尿毒症心肌病指由富含大量心脏有害物质的尿毒症内环境引起心肌细胞发生明显的病理改变[18]。其主要的特点为心肌细胞增生肥大，心肌间质纤维化和心室重构，最终将导致心室肥厚，舒张、收缩功能受损。其中左心室肥厚是透析患者最常见的心脏改变，而且是尿毒症心肌病的主要特点。尿毒症性心肌病的病理生理机制尚不清楚。目前广泛被认同可能存在的机制有因水钠潴留、贫血、动静脉内瘘造成心脏负荷增加，从而导致心室肥厚等一系列病理改变[18]。

本研究通过5/6 肾切构建尿毒症心肌病的小鼠模型，并且伴随小鼠肾功能的异常，心肌肥厚和舒张功能减退也随之出现，并且发生了收缩功能和舒张功能受损，符合尿毒症心肌病的病理生理改变。YANG 等[19]发现通过给小鼠腹腔注射IS后，其血浆IS水平升高，心室明显发生肥厚，心肌组织肥大相关蛋白ANP、BNP、β-MHC的mRNA表达也显著上调。本研究中也获得和上述研究类似的结果，模型组小鼠心肌组织ANP、BNP 蛋白表达较假手术组显著表达上调。然而在本研究中，模型组小鼠的射血分数较假手术组明显下降，考虑可能与大多模型组小鼠已进入了心力衰竭失代偿期有关。同时模型组小鼠的舒张功能较假手术组E/A 上升，这是由于模型组有几只小鼠E/A 比值已超过2，也提示其已进入心衰失代偿期。

图2 假术组与模型组小鼠心脏HE染色（a.×50倍，b.×200倍）Fig.2 HE staining of mouse heart between sham group and model group（a.×50，b.×200）

IS 作为CKD患者体内主要的内毒素，对心脏有直接毒性作用[20]。有研究者发现使用IS 培养大鼠原代心肌细胞后，IS与心肌细胞相关肥大蛋白的表达呈剂量浓度依赖性相关。而且IS是CKD患者发生LVH的重要危险因素，肾功能越差的患者体内IS水平越高[23]。本研究对尿毒症心肌病小鼠检测血浆IS水平，结果与上述实验结果相似，即模型小鼠血浆IS水平较假手术组明显升高。所以，降低CKD患者，尤其是终末期肾功能不全患者的IS水平可能成为临床上预防及治疗尿毒症心肌病的一个重要突破口。

图3 假手术组和模型组小鼠心脏组织蛋白表达情况Fig.3 Myocardial protein expressionst between sham group and model group

图4 巨噬细胞蛋白表达情况Fig.4 Protein expression in control group and control＋IS group of macrophage

现在越来越多研究不仅证实了IS 对心脏的直接毒性作用[18-19]，还发现它可以刺激机体缓慢释放各种炎症因子，使得机体内持续产生轻微炎症反应，最终导致患者出现各种免疫性炎症的相关并发症[20]。有研究发现，TNF-α、IL-6和IL-1β 能通过诱导转录因子蛋白家族（NF-κB）活化，进而促使心肌肥厚和胶原合成，最终导致心室重构和心力衰竭[21]。本研究对心脏组织进行Western blot 验证，结果显示尿毒症心肌病小鼠Nlrp3 炎性小体表达较假手术组明显上调，同时其下游的炎症因子IL-1β表达增多。本研究还发现在模型组小鼠中Nlrp3 炎性小体上游的NF-κB 信号通路明显激活，提示尿毒症心肌病小鼠心室肥厚可能与Nlrp3 介导的炎症通路相关。为进一步证实尿毒素IS在其中起到改变尿毒症小鼠体内微环境而促进Nlrp3 炎性小体表达的重要作用，本研究通过体外实验用IS 诱导巨噬细胞后，Nlrp3 炎性小体及其下游的炎症因子IL-1β表达上调。

本研究利用小鼠制备了尿毒症心肌病模型，模拟其内环境，进一步证实了尿毒症时循环中高水平的IS可通过激活炎性小体Nlrp3诱导心室肥厚的发生，其机制与上调其表达和促进和激活下游信号通路相关。本研究的不足之处在于没有进一步通过基因敲除和过表达的方法进一步证实Nlrp3炎性小体对尿毒症心肌病的病理生理机制及相关通路的激活，有待在后续研究中进一步完善和改进。

通过本实验研究，不仅发现了尿毒症毒素IS在尿毒症心肌病中加重心室肥厚的重要作用，并进一步深入揭示了IS 可诱导Nlrp3 炎性小体表达上调，加重其对尿毒症心肌病患者相关的脏器损害。从心、肾内在关联的角度探讨了尿毒症心肌病潜在的病理生理机制和可能的防治措施。