柱前衍生-HPLC法对水蛭的指纹图谱及其16种氨基酸含量测定研究

顾念念 索亚然 乔艺涵 王昭懿 冯丹 赵霞 孟雪丹 吴怡青 李朝峰 赵崇军 马志强 林瑞超 邹迪新

水蛭药材为水蛭科动物水蛭HirudonipponicaWhitman、蚂蟥WhitmaniapigraWhitman或柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全体，具有破血通经，逐瘀消癥的功效[1]。现代药理学研究表明，水蛭具有抗血栓、抗凝血、抑制肿瘤血管生成、抗癌转移及抗炎抗菌等活性，主要有效成分为蛋白质、多肽、氨基酸及一些小分子化合物[2-3]。目前有关水蛭药材的氨基酸测定报道较多，而用相似度结合模式识别的数据分析对水蛭药材进行质量评价较少。PITC衍生剂是目前广泛使用的HPLC氨基酸分析方法，该方法方便、快速，生成的苯氨基硫甲酰衍生物单一、稳定；紫外检测(254 nm)灵敏度高，可达1 pmol，本实验采用PITC柱前衍生法建立了水蛭药材的HPLC游离氨基酸指纹图谱和含量测定的研究方法，综合指纹图谱信息、聚类分析及主成分分析将药材分为3类，结果表明该方法可为水蛭药材质量控制评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

高效液相色谱仪(Waters 2695)包括2695四元梯度泵、自动进样器、2489紫外检测器、在线脱气机、柱温箱、Empower色谱工作站。FW-200型高速万能粉碎机(北京科伟永兴仪器有限公司)； KQ-3200B型数控超声仪(江苏昆山市超声仪器有限公司)；N-1300型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；电子分析天平(Mettler Toledo 公司)；10-2AB型电热鼓风干燥箱(天津泰斯特仪器有限公司)；GTR10-2型高速冷冻离心机(北京时代北利离心机有限公司)；雷磁pH计(上海仪电科学仪器有限公司)。

1.2 药材样品与试药

水蛭药材共18批，经北京中医药大学鉴定系杨瑶君老师鉴定为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman的干燥全体，药材信息见表1。对照品(上海源叶生物科技有限公司)天门冬氨酸Asp(批号B21934)、谷氨酸Glu(批号B21916)、丝氨酸Ser(批号B21932)、甘氨酸Gly(批号B21915)、组氨酸His(批号B21938)、精氨酸Arg(批号B21920)、苏氨酸Thr(批号B21933)、丙氨酸Ala(批号B21911)、脯氨酸Pro(批号B21914)、酪氨酸Tyr(批号B21924)、缬氨酸Val(批号B21936)、蛋氨酸Met(批号B21913)、异亮氨酸Ile(批号B21937)、亮氨酸Leu(批号B21925)、苯丙氨酸Phe(批号B21910)、赖氨酸Lys(批号B21922)，上述对照品纯度均大于98%；无水乙酸钠(纯度大于99%，国药集团化学试剂有限公司)、乙腈、乙酸、正己烷色谱纯(Fisher)、三乙胺(TEA)(批号BCBH3144V)、异硫氰酸苯酯(PITC)(批号BCBB1912V)、纯水(娃哈哈纯净水)。

表1 药材批次信息

1.3 HPLC色谱分析条件

博纳艾杰尔Venusil AA氨基酸分析专用柱(4.6×250 mm，5μm)；流动相A：0.1 mol/L无水乙酸钠(pH 6.5)-乙腈(93∶7)，B：乙腈-水(4∶1)；梯度洗脱(0～14 min，0～10% B；14～22 min，10%～20% B；22～37 min，20%～30.7% B；37～41 min，30.7%～31.6% B；41～48 min，31.6%～34% B)，流速0.8 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。

1.4 溶液的制备

1.4.1 衍生溶液的配制 TEA乙腈溶液：TEA 1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混匀；PITC溶液：取PITC 25μL，加乙腈2 mL混匀。

1.4.2 标准品溶液的制备 分别取氨基酸标准品适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解为适当浓度的对照品储备液，取贮备液适量于同一容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，摇匀，分别制成天门冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、丝氨酸Ser、甘氨酸Gly、组氨酸His、精氨酸Arg、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、缬氨酸Val、蛋氨酸Met、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、赖氨酸Lys质量浓度分别为0.0670、0.3938、0.0532、0.0496、0.0260、0.0300、0.0550、0.3444、0.0428、0.0540、0.0858、0.0272、0.0612、0.0914、0.0666、0.0600 mg/mL的测定游离氨基酸样品的混合对照品溶液；天门冬氨酸Asp、谷氨酸Glu、丝氨酸Ser、甘氨酸Gly、组氨酸His、精氨酸Arg、苏氨酸Thr、丙氨酸Ala、脯氨酸Pro、酪氨酸Tyr、缬氨酸Val、蛋氨酸Met、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、苯丙氨酸Phe、赖氨酸Lys质量浓度分别为1.2304、1.6528、0.5928、0.6584、0.5588、0.7008、0.4076、0.7336、0.4956、0.5500、0.7340、0.2492、0.4588、0.9060、0.6692、1.0764 mg/mL的测定水解氨基酸样品的混合对照品溶液。

1.4.3 供试品溶液的制备 取水蛭药材粉末(过40目筛)5 g，精密称定，加入蒸馏水25 mL，摇匀，浸提45 min，超声提取60 min(500 W，100 HZ)，离心(5000 r/min)20 min，取上清液备用。 游离氨基酸样品的制备：精密取上清液4 mL，加入12 mL乙腈，摇匀，过滤，残渣加乙腈溶液(乙腈-水=3∶1)洗涤，减压挥干溶剂后，0.1 mol/L盐酸溶液定容至10 mL，0.45μm滤膜过滤即可。水解氨基酸样品的制备：精密取上清液2 mL，加入6 mol/L盐酸10 mL，摇匀，抽真空，氮气密封，置110 ℃烘箱中水解24 小时，取出水解管冷却后转移至蒸发皿中，水浴挥干盐酸并水洗数次至盐酸彻底挥干，0.1 mol/L盐酸溶液定容至10 mL，0.45 μm滤膜过滤即可。

1.4.4 标准品和供试品的衍生 准确取氨基酸标准溶液和样品溶液200 μL，分别置于1.5 mL离心管中，加入TEA乙腈溶液和PITC乙腈溶液各100 μL至每个离心管，混匀，室温放置1 小时，各加入正己烷400 μL，振摇后静置10 min，取下层溶液，0.45 μm滤膜过滤，取滤液200 μL，加800 μL水稀释，摇匀，进样10 μL。

1.5 方法学考察

精密度试验、稳定性试验、重复性试验表明相对峰面积RSD均小于3 %，符合标准。

2 结果

2.1 指纹图谱的建立与评价

2.1.1 指纹图谱的建立 将18批水蛭药材色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件》(V2.0)进行分析处理，以S10号样品色谱图为参照图谱，生成水蛭药材氨基酸指纹图谱(R)，建立了水蛭药材游离类氨基酸HPLC指纹图谱，见图1。

2.1.2 共有峰的标定与指认 根据18批药材色谱图，利用相似度软件进行数据匹配，共标定出25个色谱峰，并指认16个共有峰，见图2，游离以及水解样品图谱见图3。

图1 18批药材游离氨基酸HPLC图

注：2:Asp；3:Glu； 6:Ser； 7:Gly； 8:His； 9:Arg； 10:Thr； 11:Ala； 12:Pro； 16:Tyr； 17: Val； 18: Met； 20:Ile； 21: Leu； 23: Phe； 25:Lys图2 18批药材对照图谱

注：1:Asp； 2:Glu； 3:Ser； 4:Gly； 5:His； 6:Arg； 7:Thr； 8:Ala； 9:Pro； 10:Tyr； 11: Val； 12: Met； 13:Ile； 14: Leu； 15: Phe； 16:Lys图3 药材水解样品(A)、游离样品(B)、混合氨基酸对照品(C)和空白(D)HPLC图

2.2 相似度评价

采用相似度软件对药材的色谱图进行相似度评价，结果18批药材的相似度均>0.960，说明不同批次的药材之间的游离氨基酸化学组成一致性较好，符合指纹图谱的要求，可以建立共有模式。

2.3 聚类分析

将18批药材的25个共有峰峰面积相对于进样浓度标准化作为变量导入SAS8.2软件，以离均差平方和法对其进行聚类，结果见图4。当判别距离为6时，可以分为三类，S5、S6、S7、S8、S9、S10为一类，S1、S3、S11、S12、S14、S15、S17、S18为二类，S2、S4、S13、S16为三类，表明不同产地的水蛭成分含量存在一定的差异，同一产地水蛭药材成分也存在差异，原因可能与水蛭生活环境，所食食物及采收加工方式有关。

2.4 主成分分析

分别以水蛭药材游离氨基酸指纹图谱中25个共有峰的峰面积为变量，采用SIMCA-13.0分析软件进行主成分分析，并作主成分得分图和载荷图，见图5、图6。

由图5可知18批药材可分为三类，S5、S6、S7、S8、S9、S10为第一类，S1、S3、S11、S12、S14、S15、S17、S18为第二类，S2、S4、S13、S16为第三类，与聚类分析结果一致。因子载荷是主成分与原始变量的相关系数，由图6可知P6 (Ser)、P7(Gly)、P10(Thr)离原点较远，即载荷较大，表明这些共有峰在区分不同批次水蛭药材中起着很大作用。

图4 18批药材聚类分析图

图5 18批药材主成分得分图

图6 18批药材主成分载荷图

2.5 含量测定

2.5.1 方法学考察 精密度试验、稳定性试验表明保留时间和峰面积RSD均小于3 %，重复性试验除游离样品His 、Met 的峰面积RSD为3.65 %、4.30%外，均小于3 %，线性关系考察r值在0.999 ～1.000之间，符合标准，加样回收率试验中游离氨基酸的加样回收率在98.43%～102.34%，RSD在1.71%～4.23%，水解氨基酸的加样回收率在97.12%～101.26%，RSD在1.20%～3.77%。

2.5.2 样品的测定 取18批不同批次的水蛭药材，按1.4项下方法制备供试品试液，按1.3项色谱条件测定，回归方程进行计算，结果见表2、3。

表2 游离氨基酸成分的含量测定结果(mg/g)

表3 水解氨基酸成分的含量测定结果(mg/g)

3 讨论

本实验前期以色谱峰的数目、分离度、峰型等色谱参数为指标，比较了提取溶剂的量(20 mL，25 mL，30 mL)以及浸泡时间(30 min，45 min，60 min)和超声时间(30 min，45 min，60 min)，对供试品溶液制备方法进行了考察，最终确定25 mL水浸泡45 min，超声60 min，5000 r/min离心20 min即可提取完全；并考察了不同流动相系统(5 %乙腈0.1 mol/L无水乙酸钠水溶液 - 80 %乙腈水溶液，7%乙腈0.1 mol/L无水乙酸钠水溶液-80%乙腈水溶液，10%乙腈0.1 mol/L无水乙酸钠水溶液-80%乙腈水溶液)，不同流速(0.6 mL/min，0.8 mL/min，1 mL/min)，最终采用峰型较好、出峰时间合适的7%乙腈0.1 mol/L无水乙酸钠水溶液-80%乙腈水溶液为流动相，流速为0.8 mL/min。

本实验收集了18批不同产地的水蛭药材，建立了水蛭药材的游离类氨基酸指纹图谱，并较为全面地分析了18批药材中16种氨基酸的含量，结果表明不同批次的水蛭药材氨基酸含量差异很大，水解氨基酸中含量最高的Glu 含量范围为7.26～18.36 mg/g，游离氨基酸中含量最高的Ala的含量范围为1.43～ 4.39 mg/g。相似度评价分析发现18批药材间相似度在0.960以上，说明药材间质量较稳定，而由因子载荷分析可知Ser、Gly、Thr对不同批次水蛭药材的区分有较大贡献，含量测定结果结合聚类分析、主成分分析说明即使同一产地的药材也存在一定的差异。在实验条件下，游离氨基酸样品和水解总氨基酸样品中均未检测出Cys，与文献[4]报道一致。

由于中药指纹图谱整体性和模糊性的特点，单纯比较其相似度说服力弱[5]，因此本实验结合聚类分析和主成分分析对不同产地的水蛭药材进行质量评价，从水蛭药材氨基酸成分着手，较为全面地评价了水蛭药材中氨基酸成分及其含量，建立了其指纹图谱和含量测定方法，为水蛭药材的后续研究提供一定的参考依据。