基于UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析刺果番荔枝叶的化学成分

肖治均 杨欣欣 梅矩铭 王梓轩 李娅琦 刘春生 雷海民 徐拥军 陈吓第 王学勇 马长华

肿瘤是一种多见疾病，其发病率与死亡率在世界范围内迅速增长[1]。刺果番荔枝作为一种天然的抗癌药物，俗称作“癌症杀手”，能导致多种肿瘤细胞发生凋亡，已经证实其对肝癌、前列腺癌、乳腺癌和皮肤癌有一定的抑制作用[2-5]。刺果番荔枝AmronamuricataL.又称红毛榴莲，为番荔枝科，番荔枝属(Annoaceae)中的一个栽培种，原产于南美洲。目前，在中国海南、云南、广东和广西等地均有引种栽培[6]。现代药理学研究表明，番荔枝内酯类和生物碱类是该植物的主要化学成分，具有抗肿瘤、抗疟和抗寄生虫的活性[7]。自20世纪80年代以来，人们发现该植物的种子和叶片具有抗癌和抑菌作用，引起了研究者的广泛关注，在南美和非洲等地，该植物已被用于治疗癌症，具有发展为天然抗癌药的潜力[8-9]。

天然植物化学成分复杂，利用传统的提取、分离、纯化并结合NMR技术研究天然植物中的化学成分，不仅方法繁琐，且耗时费力[10]。近年来，液相色谱-质谱联用( LC-MS )技术已成为天然植物中化学成分快速分离与鉴定的强有力手段[11-13]。LTQ-Orbitrap-MS是近年来发展起来的一项新质谱联用技术，其综合了LTQ的多级质谱功能以及Orbitrap的高分辨能力，可在较短时间内同时实现对母、子离子的高分辨采集和多级质谱碎裂，显著提高了复杂体系中化学成分的快速鉴别与分析能力[14-15]。目前，对刺果番荔枝中化学成分的研究仅限于传统提取分离手段结合半制备色谱法等，且多集中于种子和根部[16-20]，未见LC-MS法表征刺果番荔枝叶化学成分的报道。

本研究拟利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术对刺果番荔枝叶中多种化学成分进行快速准确识别，通过查阅文献，总结各类化合物的裂解规律，建立各类化合物的识别方法，以期为刺果番荔枝叶的提取分离与药效物质基础的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器

LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-串联静电轨道场质谱仪，配有热电喷雾离子源(HESI)，Xcalibur 2.1 工作站(美国Thermo Fisher Scientific公司)，DFT-50A-型粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，BS110S 1/1 万天平(德国Sartorius仪器有限公司)，KQ-300DB型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药材与试剂

刺果番荔枝叶采于厄瓜多尔瓜亚基尔市，经北京中医药大学中药学院刘春生教授鉴定为番荔枝科，番荔枝属刺果番荔枝AmronamuricataL.的干燥叶片。乙腈(质谱纯，Fisher公司)，甲酸(质谱纯，德国 Merk公司)，超纯水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)，其他试剂均为市售分析纯(北京化工厂)。

1.3 供试品溶液的制备

取适量干燥刺果番荔枝叶，粉碎机粉碎，过 60 目筛，精密称定粉末1.0 g置100 mL锥形瓶中，精密加入 95% 乙醇50 mL，超声提取( 功率300 W，频率40 kHz ) 30 min，取出，冷却至室温，取上清液经0.22 μm滤膜滤过，即得刺果番荔枝叶样品溶液。

1.4 色谱条件

Acquity UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流动相0.1% 甲酸水( A )-乙腈(B)；梯度洗脱程序：0～9 min (5%～60% B)，9～12 min (60% ～ 70% B)，12～28 min (70%～90% B)，28～29 min (90%～5% B)，29～33 min (5%～5% B)；流速为0.3 mL/min；进样量2 μL；进样室温度4 ℃；柱温 30 ℃。

1.5 质谱条件

LTQ-Orbitrap XL线性离子阱-串联静电轨道场质谱仪，HESI 电喷雾离子源，正负离子检出模式，离子源温度 350 ℃，电离源电压 4 KV，毛细管电压：35 V，管透镜电压：110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气流速 40 arb，辅助气流速：20 arb；激活能量单位：0.25 q；激活时间：30 ms；归一化碰撞能量：35%；傅里叶高分辨扫描范围m/z100～1500 Da；样品采用傅里叶变换高分辨全扫方式(FT，Full scan，Resolution 30000)，二级和三级质谱采用数据依赖性(data-dependent acquisistion) ddMS2和 ddMS3扫描，选取上一级丰度最高的3个色谱峰进行碰撞诱导解离( CID )碎片扫描。

1.6 化学成分的鉴定

色谱及质谱条件下，分别测定正、负离子模式下刺果番荔枝叶的总离子流图，使用Xcalibur软件( Thermo Fisher Scientific )对质谱数据进行分析，通过一级高分辨率质谱信息推导其可能的分子式，质谱偏差范围 δ ≤ 5×10-6。由Reaxys数据库检索番荔枝属化学成分相关信息，包括化合物名称、分子式和结构式。根据各化合物的特征裂解规律分析鉴别化合物，并结合相关文献数据报道对鉴别的化学成分做进一步确认。

2 结果

在质谱正、负离子模式下共推测鉴定出 45 个化合物，包括16个生物碱类，14个番荔枝内酯类，8个黄酮类和7个其他类化合物。刺果番荔枝叶在正负离子模式下质谱的BPI图见图 1，45 个化合物的详细数据见表 1。

注： ( A )正离子；( B )负离子图1 刺果番荔枝叶 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS质谱基峰离子流图

表1 刺果番荔枝叶化学成分质谱鉴定结果

续表

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2.1 刺果番荔枝叶中生物碱类成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在刺果番荔枝叶质谱的正离子模式下共检测出16个生物碱类化合物，其中包括苄基异喹啉类8个( 化合物5、7、11、13、18、19、20和21 )，阿朴啡类5个( 化合物6、8、9、22和23 )和四氢原小檗碱类生物碱2个( 化合物28和29 )。

2.1.1 苄基异喹啉类生物碱的鉴定 苄基异喹啉类生物碱的质谱特征是C1的苄基裂解，生成四氢异喹啉离子和互补的苄基离子，裂解主要受氮原子支配，主要裂解方式是以氮原子为中心的 α 裂解等，且多涉及骨架的裂解[21]。利用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术结合化合物的裂解规律以及文献报道从刺果番荔枝叶中鉴定的苄基异喹啉类生物碱有化合物5去甲乌药碱[22]、7乌药碱、11和20网状番荔枝碱[23]与其异构体、13和21 N-甲基乌药碱与其异构体、18莲心季铵碱和19杏黄罂粟碱。

2.1.2 阿朴啡类生物碱的鉴定 阿朴啡类生物碱主要的裂解行为表现在B环上的逆狄尔斯-阿德尔(RDA)裂解，失去CH2= N-R基团，R基团可为H和CH3，即得到[M+H-29]+和[M+H-43]+离子，用以区分N上是否含有甲基[24]。从刺果番荔枝叶中鉴定的阿朴啡类生物碱有化合物6新木姜子碱、8 Apoglaziovine、9异紫堇块茎碱、22 Lirinidine和23降月桂碱。

2.1.3 四氢原小檗碱类生物碱 四氢原小檗碱类的基本骨架是苯二亚甲基与四氢异喹啉的两处连接，构成一个中间有两个脂肪环的四环系统，C环发生RDA裂解，生成两个互补的碎片离子。化合物28紫堇达明碱和29番荔枝宁是从刺果番荔枝叶中鉴定出的四氢原小檗碱类生物碱。

2.1.4 其他类生物碱的鉴定 除上述三种生物碱类化合物，从刺果番荔枝叶中还鉴定出一个其他类生物碱，化合物N-p-香豆酰胺 (N-p-Coumaroyltyramine)，质谱上的分子离子峰m/z284.12903[M+H]+，推测其可能的分子式为 C17H18NO3，质量偏差为0.910×10-6，形成m/z146.97[M+H-C8H11NO]+的基峰，经高分辨精确分子量和碎片信息推测化合物24为N-p-香豆酰胺(N-p-Coumaroyltyramine)。

2.2 刺果番荔枝叶中黄酮类成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

在刺果番荔枝叶质谱负离子模式下，鉴定出7个黄酮类化合物( 化合物12芦丁[25]、14金丝桃苷、15山奈酚3-O-芸香糖苷、16水仙苷、17紫云英苷、26槲皮素[26]和27山奈酚 )，此黄酮类化合物在质谱上表现出的裂解规律多以糖基的丢失和苷元发生特征裂解丢失H2O、-CH3、-CO以及-OCH3等基本官能团和发生RDA裂解。

2.3 刺果番荔枝叶中番荔枝内酯类成分的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析

番荔枝内酯类化合物( Annonaceous acetogenins ACGs)，分子中除了1个五元内酯环的端基外，链中还有1至2个四氢呋喃环，另外还含有羟基，这类化合物的质谱碎片离子是由于四氢呋喃环或羟基引起的 α-裂解所致，所得离子还能连续失水或由内酯环失去一氧化碳[27]。正离子模式下鉴定出14个番荔枝内酯类化合物( 化合物31 Annoglaxin、32和34 Murihexocin B与其异构体、35、36和37 Annomonicine与其异构体、38番荔枝素A、39和42 Neoannonine与其异构体、40 Corepoxylone、41异番荔枝素、43 Annonacinone、44番荔枝宁-VI和45 Corepoxylone)。

2.4 其他类成分的鉴定

通过刺果番荔枝叶的质谱数据，还鉴定出除生物碱、黄酮和番荔枝内酯以外的化合物，如化合物1蔗糖[28]、2奎尼酸、3咖啡酸和4绿原酸。

3 讨论

本文应用 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS 技术对刺果番荔枝叶中的化学成分进行表征分析，通过分析高分辨精确分子量、色谱保留时间和多级质谱碎片离子等信息，并结合相关文献报道，共鉴定出45个化合物，包括生物碱类、番荔枝内酯类、黄酮类和其他类化合物，其中以生物碱类和番荔枝内酯类化合物居多，与文献报道的刺果番荔枝发挥主要的抗癌类成分一致。其中去甲乌药碱和番荔枝宁据现代药理研究表明具有镇静、强心和抗疟活性[29-30]；番荔枝内酯类化合物除具有神经毒性和杀虫效果外，还具有良好的抗肿瘤和细胞毒性作用[31]，是发挥抗癌作用的主要药效物质。刺果番荔枝叶中的化学成分丰富，生物活性多样，可对其发挥药效的作用机制深入研究。本研究为刺果番荔枝叶中化学成分的定性研究提供了一种快速准确的鉴定方法，为刺果番荔枝叶的提取分离以及药效物质基础研究提供了进一步的参考。但本实验只是通过一级高分辨的精确分子量、二级特征碎片信息和相关文献数据报道推断化合物的可能裂解途径，缺少化学标准品的比对，其准确性有待进一步验证，尤其是同分异构体的存在。