益气活血方对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡影响的研究

占天为 郭书文 陈曦 莫涵瑢 王惠 冯鹏飞 魏路路

缺血性心脏病是全球范围内人类死亡和致残的主要原因。持续的心肌缺血会导致心脏组织的多重损害[1]。心肌梗死(myocardial infarction，MI)是冠状动脉疾病的常见表现，特征是持续性和严重心肌缺血引起部分心肌细胞死亡[2]。研究发现，凋亡是受基因控制的程序性细胞死亡，并且是心肌细胞主要的细胞死亡方式[3]。细胞凋亡在心肌梗死的发病机理中起关键作用，终末分化心肌细胞的丢失引起心肌纤维化，心室扩张，心脏重构，心脏功能逐渐下降，加剧心力衰竭的发展[4]。由于心肌细胞的再生能力有限，靶向抑制凋亡成为改善心肌缺血损伤有前景的治疗策略。研究表明，Bcl-2家族蛋白质如Bcl-2和Bax，在调节程序性细胞死亡中起重要作用[4]。本研究旨在探讨益气活血方通过调节Bax和Bcl-2的表达对心肌梗死大鼠细胞凋亡分子机制的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

从北京维通利华实验动物技术有限公司订购60只健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，8周龄，SPF级，体重180～220 g，动物许可证编号：SCXK(京)2016-0006，实验期间将动物饲养于北京中医药大学实验动物房温度：(21±2)℃，湿度：(50±5)%，每天光照12小时。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂 益气活血方由5味中药组成：生黄芪50 g、生晒参10 g、当归15 g、三七6 g、川芎15 g，中药材由北京中医药大学国医堂门诊部提供。口服剂制备工艺：称取40剂益气活血方，中药提取3次，第1次加10倍量水煎煮2小时，过滤，第2、3次分别将前1次过滤后得到的药材在8倍量的水中煎煮1小时，共4小时，最后，将过滤后的溶液混匀，浓缩成含有0.82 g·mL-1生药量的中药煎剂。阳性对照药培哚普利[施维雅(天津)制药有限公司生产]，4 mg/片，国药准字：H20034053，临用时以无菌蒸馏水充分溶解。主要试剂：一抗Bax、Bcl-2、c-caspase 3(英国Abcam公司ab182733、ab196495、ab49822)，辣根酶山羊抗兔IgG二抗(北京鼎国，SH-0031)，ECL化学发光试剂盒(Thermo，34094)。

1.2.2 仪器 Vevo770高分辨小动物超声系统(加拿大Visual Sonics公司生产)，小动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司，HW-101E)，心电图机(广州三锐电子科技有限公司，ECG-3312)，高压灭菌锅(日本Sanyo公司，MLS-3750)，石蜡包埋机(德国Leica，EG1150)。

1.3 心肌梗死大鼠模型的制备及分组

1.3.1 心肌梗死大鼠模型的制备 通过开胸手术结扎左冠状动脉前降支(LAD)的方法制备大鼠心肌梗死模型。大鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1) 麻醉后，仰卧位固定。垂直切开大鼠颈中部的皮肤，长度约1 cm。将皮下组织与颈部肌肉分开以暴露气管。气管横向切开后，将气管插管放置在第三或第四环状软骨的水平处，固定气管插管后与动物呼吸机相连以辅助大鼠呼吸。胸部备皮消毒后，沿左侧3～4肋间间隙开胸，撕开心包膜后可见心脏。心脏大静脉作为标记，使用5/0带线缝合针于左心耳下缘约2 mm位置结扎左冠状动脉前降支。观察左心室心肌的运动及颜色变化，室壁运动减弱、结扎部位及周围心肌变白认为手术结扎成功。排空胸腔积液，关闭胸腔，缝合皮肤切口。待大鼠麻醉清醒后撤掉呼吸机，随后对大鼠进行密切观察，并在必要时按照手术程序进行处理，以提高动物的存活率。术后第二天进行心电图(ECG)检查，图纸中出现5～8个病理性Q波(观察I、avL、V1-V6导联)表明模型制备成功。假手术组大鼠则将手术线穿过肺动脉圆锥与左心耳之间，不进行结扎，且无上述病理表现。

1.3.2 分组及给药 将造模成功的动物随机分为4组：假手术组(即对照组)、模型组、益气活血组、培哚普利组，每组10只。益气活血组从手术次日开始每日给予8.2 g·kg-1·d-1(经课题组前期研究确定的剂量)的中药灌胃治疗。培哚普利组：手术次日开始灌胃给药，根据等效剂量换算公式计算出给药量：0.4 mg·kg-1·d-1。其余各组大鼠均给予与治疗组相同体积的无菌蒸馏水灌胃作对照。每日1次，连续给药4周并检测各组大鼠第28天心肌组织的指标情况。

1.4 超声检测心脏左室功能

术后4周通过腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉实验大鼠，备皮，使用30 MHz高分辨率Vevo 770小动物超声仪器探头进行超声心动图检查，以评估左心室的结构和功能。记录左心室短轴乳头肌水平上获得的M型曲线，从三个连续心动周期中获取参数并取平均值。参数包括：左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular shortening fraction, LVFS)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic dimension，LVESD)和左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)。

1.5 HE染色

通过HE染色评估左心室心肌细胞的形态学变化。用4%多聚甲醛固定心脏组织，固定24小时后石蜡包埋，制成5 μm切片，切片去石蜡，再水化，使用苏木精-曙红(HE)染色。通过光学显微镜观察心肌梗死边缘区组织的细胞结构(放大倍数，×200)。

1.6 TUNEL染色测定心肌细胞凋亡

使用凋亡检测试剂盒进行TUNEL染色。将4%多聚甲醛固定的心脏组织石蜡包埋，制成4 μm切片。脱石蜡后，切片与蛋白酶溶液在37°C下反应5分钟，随后加入TdT反应溶液(TdT∶TdT底物溶液=1∶100)，10分钟。室温下，于3%H2O2封闭液中封闭5分钟以抑制内源性过氧化物酶活性。切片与过氧化物酶(POD)偶联抗体孵育10分钟，37°C。室温下，切片与DAB+底物色原系统(Dako)孵育5分钟，使TUNEL阳性细胞核显色。细胞核用苏木精复染。使用配备有显微镜摄像头的光学显微镜获得图像，每张切片随机选取5个高倍视野(×400)，对各组的凋亡细胞进行计数，并计算凋亡指数(apoptosis index，AI=阳性凋亡细胞数/总细胞数×100%)。

1.7 Western blot检测梗死边缘区Bax、Bcl-2、C-caspase 3蛋白表达

取用梗死边缘区域的心肌组织样品，用于蛋白质分析。心脏组织样品中加入含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液，研磨成匀浆，并使用BCA蛋白测定试剂盒对蛋白质进行定量。将40 μg蛋白质样品在12%SDS-PAGE凝胶上电泳，然后转移到PDVF膜上。使用含5%脱脂奶粉的封闭液室温封闭PDVF膜2小时，并与以下一抗在4°C下过夜孵育：Bax(1∶2000)，Bcl-2(1∶1000)，C-caspase3(1∶500)。用TBST缓冲液洗涤后，将PDVF膜与二抗(山羊抗兔IgG，浓度1∶5000)孵育2小时。应用ECL检测试剂盒使蛋白质条带可视化，胶片曝光。对胶片进行扫描，使用Image J软件计算目的条带灰度值，各组蛋白分别与内参β-action作比值得出相对光密度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠心脏超声结果

与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS均降低(P<0.01)，LVESD、LVEDD均升高(P<0.01)；与模型组比较，益气活血组和培哚普利组大鼠LVEF、LVFS均升高(P<0.01)，LVESD、LVEDD均降低(P<0.01)。见表1。

2.2 各组大鼠HE染色结果

HE染色后，假手术组大鼠左心室的心肌细胞彼此平行且在光学显微镜下呈有序排列。细胞结构未被破坏，大小正常，中心是椭圆形的核，横向条纹明显可见。模型组大鼠心肌细胞萎缩，细胞色素沉着，细胞质增生，心肌纤维断裂。还观察到炎性细胞的浸润以及纤维细胞和纤维成分的增加。益气活血组和培哚普利组染色相对均匀，梗死部位的纤维组织增生和炎性细胞浸润较模型组得到了改善，细胞结构破坏程度较轻。见图1。

2.3 各组大鼠TUNEL染色结果

凋亡心肌细胞的细胞核呈棕褐色，而非凋亡心肌细胞的细胞核呈蓝色。假手术组大鼠的心肌细胞核基本呈蓝色，偶有几个阳性细胞核。心肌梗死后28天，在模型组中，梗死区域周围的细胞主要是凋亡细胞。与假手术组相比，心肌细胞凋亡指数明显增加(P<0.01)。与模型组比较，益气活血组和培哚普利组的凋亡细胞数量明显减少，凋亡指数的差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2、图2。

表1 各组大鼠心脏超声数据结果比较

注： 与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

注：A：假手术组；B：模型组；C：益气活血组；D：培哚普利组。图1 各组大鼠梗死边缘区心肌细胞染色结果(HE×200)

注：A：假手术组；B：模型组；C：益气活血组；D：培哚普利组。图2 各组大鼠心肌细胞凋亡染色结果(TUNEL×400)

表3 益气活血方对大鼠梗死边缘区Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax、C-caspase3蛋白表达的作用

注：与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05。

表2 各组大鼠心肌组织TUNEL染色凋亡指数结果

注： 与假手术组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01。

2.4 各组大鼠Western blot检测结果

与假手术组比较，模型组大鼠的Bax、C-caspase 3均升高(P<0.01)，Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax降低(P<0.01)，说明心肌梗死后模型组大鼠的细胞凋亡程度较重。与模型组比较，益气活血组大鼠Bax蛋白表达有所下降(P<0.01)，Bcl-2蛋白表达与Bcl-2/Bax比值显著升高(P<0.05，P<0.01)，C-caspase 3蛋白表达有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；培哚普利组大鼠Bax表达降低(P<0.01)，Bcl-2/Bax比值上升(P<0.05)，Bcl-2呈升高趋势，C-caspase 3有下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3。

注：J：假手术组；M：模型组；Z：益气活血组；P：培哚普利组。图3 各组大鼠蛋白表达电泳结果

3 讨论

益气活血方在当归补血汤的基础上加人参、川芎、三七配伍而成，是郭书文教授治疗胸痹心痛的经验用药，临床上对于心肌缺血有较好的治疗效果[5]，经课题组前期研究发现益气活血方具有多种药理作用，包括抗炎、抗纤维化和神经保护特性[6-8]。本实验使用经典的心肌梗死大鼠模型以探究益气活血方对心肌梗死大鼠心脏结构和功能以及心肌细胞凋亡损伤的保护机制，为使益气活血方的药效评价更加客观，选用培哚普利[9]作为阳性对照药。

心肌梗死是心血管疾病患者的常见死亡原因。心肌梗死常发生血流动力学异常，心脏舒张和收缩功能降低，心肌耗氧量增加[10]。在这项研究中，与假手术组比较，模型组大鼠的LVEF和LVFS显著降低，LVEDD和LVESD升高。与模型组相比，益气活血组的LVEF、LVFS上升，LVEDD和LVESD明显下降，这表明益气活血方可改善心脏的收缩和舒张功能，改善心室顺应性，减轻心肌缺血损伤。

心肌是终末分化的组织，因此发生缺血性疾病时保持心肌细胞的活力至关重要。缺血性心脏中细胞凋亡广泛存在，特别是在梗死周围区域，在很大程度上阻碍了心脏功能的恢复。因此，在心肌缺血期间抑制细胞凋亡的发生对于保护心脏功能至关重要。Bcl-2家族是凋亡通路的有效调节剂，它既包括抗凋亡蛋白又包括促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在线粒体介导的细胞凋亡中起重要作用[11]。Bcl-2/Bax比值决定细胞凋亡是否发生，增加Bax/Bcl-2比值激活凋亡途径，与此同时，增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达或降低促凋亡蛋白Bax的表达能够抑制线粒体凋亡途径[12]。caspase家族在一定程度上对细胞凋亡的调节也很重要。caspase 3是诱导细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶激酶家族的成员，caspase 3的激活可以引起心肌细胞凋亡。凋亡蛋白酶激活因子1、细胞色素-C和caspase-9的结合激活下游的caspase 3从而导致细胞凋亡[13]。研究发现，促凋亡的Bax和caspase-9能够诱导C-caspase 3的表达，而抗凋亡的Bcl-2能抑制其表达[14]。本实验研究表明，与模型组相比，益气活血方干预组TUNEL阳性细胞数量明显减少，Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值升高，Bax表达降低，但对C-caspase 3蛋白的下调作用不显著。表明益气活血方通过上调Bcl-2/Bax比值，促进抗凋亡因子的表达，减少促凋亡因子的释放抑制细胞凋亡，这可能是益气活血方保护心肌缺血性损伤的机制。综上推测，益气活血方通过有效调节Bax、Bcl-2及Bcl-2/Bax的表达以改善与凋亡相关的损伤，从而发挥保护心脏的作用。