人参多糖对乙醇依赖小鼠戒断行为及血浆ACTH和皮质醇的影响

卢 梦，王 鑫，宋 伍，周东月，王慧玲，魏 琳，卞 男，李雪婷，郭 焱

0 引言

乙醇依赖是一个全球性问题。长期摄入乙醇停药后会引起严重的包括中枢神经系统过度兴奋、震颤、焦虑、失眠和癫痫发作等戒断症状[1-3]。研究显示，乙醇中毒和戒断能激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴，提高啮齿动物皮质酮循环和增加皮质醇水平，表现为饮酒量的增加[4]。临床研究显示，即使经过长期的戒断，乙醇依赖患者仍然有更高的复发饮大量酒的风险，乙醇依赖戒断患者接受乙醇相关刺激会释放皮质醇[5-6]。动物实验显示，在急性乙醇戒断时，血浆皮质醇水平显著升高，而ACTH水平降低[7]。

人参多糖(Ginseng polysaccharides，GSP)作为人参(Panax ginseng C.A.Mey.)的主要化学成分之一，具有广泛的生物学活性，包括免疫调节、抗氧化、降血糖和神经保护等作用[8-13]。近年研究显示，人参多糖具有调节内分泌的作用，可显著提高大鼠血浆ACTH含量[14-15]。目前，尚无人参多糖对乙醇成瘾作用的报道。因此，本研究建立了乙醇依赖模型，观察人参多糖对乙醇依赖戒断小鼠血浆ACTH和皮质醇及焦虑相关行为的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 6周龄KM雄性小鼠(22±2) g，购于吉林省长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，饲养于长春中医药大学实验中心。实验开始前将小鼠适应性饲养5 d，实验期间自由获取食物和水，饲养室温湿度分别控制在(23±2)℃和50%±5%范围内，12 h/12 h明暗交替。动物许可证号：SCXK(吉)2011-0004。

1.2 试剂与仪器 无水乙醇(北京化工厂，批号：20180518)，促肾上腺皮质激素(ACTH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，皮质醇(Cortisol)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，明暗箱(上海欣软信息科技有限公司)，PMT-100高架十字迷宫(成都泰盟科技有限公司)。

1.3 药物 人参多糖粉末由吉林省中医中药研究所提供，制备方法沿用实验室前期的方法。人参粉碎，采用水提醇沉法和Sevag除蛋白法得到人参多糖粗提物，粗提物用0.002 mol/L NaCl溶解，至已用0.002 mol/L NaCl平衡的DEAE-T0Y0PAERL柱上，用上述溶剂洗脱。再用0.002～0.25 mol/L NaCl梯度洗脱，得分子量为5.5×103～2.5×104的多糖部分。

2 实验方法

2.1 分组、造模及给药 将小鼠随机分为5组：空白组、模型组和GSP 3个剂量组(100、200、400 mg/kg)，每组20只。模型组及GSP 3个剂量组分别灌胃给予生理盐水和人参多糖溶液，30 min后，除空白组外，其余各组腹腔注射2.5 g/kg乙醇溶液(20%，v/v，生理盐水配制)，1次/d，连续给药15 d。每组10只，用于行为学检测，另外10只在乙醇末次给药后24 h后处死，取血，用于ACTH和皮质醇含量的检测。

2.2 明暗箱实验 连续给予乙醇15 d后，停药24 h进行明暗箱实验。明暗箱由暗室(27 cm×17 cm×27 cm)和明室(27 cm×27 cm×27 cm)(明室内装有550～650勒克斯的照明灯)组成，两室由一个中央开口(6 cm×6 cm)的挡板隔开，小鼠可以通过它在两室之间自由穿梭。将小鼠置于明室中央，记录10 min内在两室间穿行次数及在明室滞留时间。每次实验开始前用75%的乙醇擦拭，以去除前一只小鼠的气味。

2.3 高架十字迷宫实验 高架十字迷宫由高出地面50 cm的2个相对的开放臂(30 cm×6 cm×0.6 cm)，2个相对的闭合臂(30 cm×6 cm×15 cm)及连接四臂的中央平台(6 cm×6 cm)组成。在明暗箱实验结束后，小鼠被置于高架十字迷宫中央进行5 min的自由探索，之后记录5 min内小鼠进入开臂和闭臂的次数及其停留时间。每次实验开始前用75%的乙醇擦拭高架十字迷宫。

开臂次数比=开臂次数/(开臂次数+闭臂次数)×100%

开臂时间比=开臂时间/(开臂时间+闭臂时间)×100%

2.4 乙醇戒断症状评分 末次给予乙醇后24 h、48 h、72 h观察5 min内小鼠的戒断症状，观察每只小鼠以下的行为体征：刻板行为、激惹行为、尾巴强直和异常姿势。刻板行为包括理毛、嗅、摇头、咬和咀嚼5种，依据表现出刻板行为的种类计为1、2、3、4、5分。激惹行为计分标准：轻微或中等激惹记为1分，极易激惹记为2分，接触时叫或中等攻击性记为3分，接触时叫或极具攻击性记为4分，自发性叫或极具攻击性记为5分。尾巴强直计分标准：轻度尾巴强直记为1分，中度尾巴强直记为2分，尾巴强直但行走时有轻度弹性记为3分，尾巴强直且行走时无弹性记为4分，尾巴极度强直且行走时无弹性记为5分。异常姿势计分标准：轻微低头拱背记为1分，中度低头记为2分，显著低头拱背记为3分，低头拱背加后肢分开记为4分，低头拱背加前肢分开记为5分。

2.5 乙醇戒断小鼠血浆ACTH、皮质醇水平的变化 每组取10只小鼠，摘眼球取血，-20 ℃保存。检测方法为竞争法，操作步骤按试剂盒说明书进行。

3 结果

3.1 人参多糖对小鼠乙醇戒断后焦虑行为的影响

3.1.1 明暗箱实验 与空白组小鼠比较，模型组小鼠在明暗室中穿梭次数减少，在明室停留时间缩短(P<0.05)；与模型组小鼠比较，预先给予中、高剂量的GSP可以明显增加乙醇戒断小鼠在明暗室中穿梭次数，延长在明室停留时间(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠明暗室穿梭次数和在明室停留时间比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.1.2 高架十字迷宫实验 与空白组比较，模型组进入开臂次数比降低(P<0.05)，在开臂停留时间缩短(P<0.05)，提示小鼠慢性乙醇戒断出现焦虑样行为。与模型组小鼠比较，GSP中、高剂量组小鼠进入开臂次数比和在开臂停留时间比明显提高(P<0.05)，提示中、高剂量GSP对小鼠慢性乙醇戒断引起的焦虑样行为有改善作用。见表2。

表2 各组小鼠进入开臂次数比、开臂停留时间比情况(%)

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.1.3 乙醇戒断症状评分 乙醇戒断后24～72 h，模型组小鼠戒断评分均显著高于空白组小鼠(P<0.05)。与模型组比较，GSP中、高剂量小鼠戒断评分均显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠不同时间戒断评分

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3.2 人参多糖对乙醇戒断小鼠血浆ACTH、皮质醇水平的影响 血浆ACTH、皮质醇水平测试结果显示，模型组血浆ACTH水平低于空白组(P<0.05)，皮质醇高于空白组(P<0.05)。GSP中、高剂量组血浆ACTH水平高于模型组(P<0.05)，皮质醇水平低于模型组(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠血浆ACTH和皮质醇水平

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

目前，对乙醇成瘾机制的认识多集中在乙醇对多巴胺能神经通路的直接或间接作用。近年研究表明，乙醇直接刺激HPA轴对下丘脑、边缘系统和内侧前额叶皮质内糖皮质激素受体产生影响，后者进一步促进乙醇成瘾的进程[5]。Edwards等[7]在动物实验中发现，长期摄入乙醇的戒断过程影响应激相关神经通路，导致HPA轴的功能受损。慢性乙醇成瘾及复饮时皮质醇含量显著增加，并可与大脑的奖赏系统相互作用，从而增加乙醇的摄入量[16]。Rabat等[17]研究发现，乙醇戒断小鼠乙醇摄取量显著增加并伴随着血浆皮质酮浓度的升高。

已有研究证实了人参的活性成分在神经系统疾病的保护作用，如有助于预防抑郁症，间接地增强记忆以及改善焦虑等[14]。尽管此类研究集中在人参皂苷上，但近年来对人参多糖神经保护作用的研究越来越多，有报道，人参酸性多糖能改善小鼠抑郁行为[15]。人参多糖的神经保护作用提示其可能具有抗乙醇成瘾的作用。本研究建立了乙醇戒断模型用于评估人参多糖的抗戒断作用。明暗箱实验和高架十字迷宫实验结果显示，与空白组比较，模型组小鼠在明暗室中穿梭次数减少，在明室停留时间缩短，进入开臂次数比和在开臂停留时间比降低，与前期研究结果一致[18]。GSP连续给药可缓解由乙醇戒断引起的焦虑相关行为变化及戒断评分，停药后24 h小鼠的戒断体征最显著，这一结果与Zhu等[19]研究一致。因此，本研究考察了停药 24 h的ACTH和皮质醇的含量。另外，与纳曲酮治疗乙醇急性戒断的结果相似，GSP对乙醇急性戒断期血浆ACTH水平降低和皮质醇水平升高也有抑制作用[20]。

综上，人参多糖可能通过作用HPA轴的相关受体改善乙醇戒断引起的行为学改变。本研究为今后进一步研究人参多糖对乙醇成瘾的作用提供实验基础，为乙醇戒断综合征提供新的治疗药物。