石榴皮鞣质对前列腺癌细胞侵袭转移影响的研究

潘正波，张海涛，蔡海荣，胡恩平，刘 晟

0 引言

前列腺癌是泌尿生殖系中常见的肿瘤，近年来，亚洲前列腺癌的发病率及死亡率逐年升高[1]。目前，根据前列腺癌的分期，前列腺癌的治疗主要包括根治性切除术、内分泌治疗、放化疗等[2]。石榴皮为石榴科石榴属植物石榴(PunicagranatumL)的干燥果皮，鞣质为石榴皮的主要活性成分。研究表明，鞣质类成分具有较好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤活性[3-4]。

本研究以前列腺癌PC-3细胞为研究对象，研究石榴皮鞣质对前列腺癌PC-3细胞侵袭性的影响及相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

1.1.1 PC-3细胞复苏 细胞株：人前列腺癌PC-3细胞，由中国典型培养物保藏中心提供。从液氮罐中取出细胞复苏时应注意避免损伤细胞。

1.1.2 PC-3细胞培养 传代收集及计数:将细胞培养瓶放置在显微镜下,观察细胞消化并进行计数，计数细胞悬液的密度。细胞密度计数=(4个大格细胞总数/4)×104个/ml。

1.2 实验分组及石榴皮鞣质处理 将正常条件下培养细胞的PC-3分为4组，第1组为未加石榴皮鞣质的空白对照组(对照组)，第2组加石榴皮鞣质25 μg/ml，第3组加石榴皮鞣质50 μg/ml，第4组加石榴皮鞣质100 μg/ml。

1.3 划痕愈合实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动性的影响 将6×105个处于对数生长期的细胞均匀平铺到无菌6孔培养板中培养。当细胞覆盖率达到90%时进行划痕愈合实验。用10 μl Tip头在培养皿中轻轻地快速划两条平行直线，注意不要用力过大以免划伤底部，然后用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次，将6孔培养板放于倒置显微镜下观察并拍照，24 h再次观察并拍照。根据各组细胞划痕的愈合率来进行统计分析。

1.4 Transwell小室实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动性的影响 ①在没有基质胶Transwell板下室中加入500 μl的TEME高糖完全培养基，并把Transwell小室放于其中。再把培养板放于细胞培养箱中水化15 min。②在Transwell小室中加入1×105个处于对数生长期的细胞并在上室中添加200 μl不含胎牛血清的细胞培养基，再把Transwell板放在细胞培养箱中放置24 h。③24 h后用棉团把Transwell上室内部的细胞和培养基完全轻轻擦掉，然后放在预先冷冻过的多聚甲醛中浸没15 min。④将Transwell小室倒扣在桌面，并在小室滴1滴结晶紫溶液，染色10 min。⑤10 min后用无菌PBS溶液洗掉结晶紫溶液，倒置Transwell小室于桌面上干燥，再放在倒置显微镜下观察。⑥在10×显微镜下观察各组穿过的细胞数目，并进行统计分析。

1.5 Transwell小室侵袭实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响 ①在有基质胶的Transwell板下室中加入500 μl的TEME高糖完全培养基，并把Transwell小室放于其中；再把培养板放于细胞培养箱中水化15 min。②在Transwell小室中加入1×105个处于对数生长期的细胞，并在上室中添加200 μl不含胎牛血清的细胞培养基，再把Transwell板放在细胞培养箱中放置24 h。③24 h后用棉团把Transwell上室内部的细胞和培养基完全轻轻擦掉，然后放在预先冷冻过的多聚甲醛中浸没15 min。④将Transwell小室倒扣在桌面并在小室滴1滴结晶紫溶液，染色10 min。⑤10 min后用无菌PBS溶液洗掉结晶紫溶液，倒置Transwell小室于桌面上干燥，再放在倒置显微镜下观察。⑥在10×显微镜下统计各组穿过的细胞数目，并进行统计分析。

1.6 肺转移模型实验检测石榴鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响

1.6.1 体内肺转移模型实验 全部实验动物均购自上海景达小动物有限公司。活体实验中，每组均有6只小鼠(6～8周龄的雄性BALB/C裸鼠)。收集培养瓶中状态良好且处于对数期生长的各组癌细胞，将前列腺癌细胞浓度调整至5×107/ml，用1 ml注射器，加等量无菌水至总溶液量为总注射量的1/2，通过裸鼠尾静脉注射制剂，每只裸鼠每日注射200 μl，并且相应的腹腔注射对照组1 ml水，石榴皮鞣质浓度分别为25、50、100 μg/ml时各1 ml。每只裸鼠每周注射2次。4周后将BALB/C免疫缺陷鼠用颈椎脱位法处死之前注入荧光素溶液(2.5 mg/25 g)。完整取出BALB/C-免疫缺陷鼠的肺脏，将BALB/C免疫缺陷鼠肺脏进行包埋切片。HE染色后显微镜下观察肺脏内的肿瘤有无转移灶并计数。

1.6.2 HE染色 经过石蜡包埋处理保存的组织样本进行包埋切片。将水化的切片置于柠檬酸抗原修复液及微波炉微波修复。随后苏木素染核。将切片浸入1%盐酸酒精中1～2 s，自来水中冲洗直至细胞核为亮蓝色为止。将切片再次依次浸泡于50%乙醇5 min、75%乙醇5 min、90%乙醇5 min、无水乙醇5 min、二甲苯5 min脱水，使用中性树脂(中杉金桥)和盖玻片封片。选择合适倍率的放大倍数观察拍照。

2 结果

2.1 划痕愈合试验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动能力的影响 划痕愈合实验结果显示，48 h之后对照组细胞的划痕愈合速度较快，其愈合能力明显强于石榴皮鞣质处理的细胞，其48 h愈合率分别为84.76%、61.45%、35.87%、24.56%(P<0.05)。结果表明，石榴皮鞣质对前列腺癌细胞运动具有抑制作用。见图1。

图1 划痕愈合试验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动能力的影响

注：A.划痕愈合试验检测对照组和石榴皮鞣质组细胞的迁移能力，B.划痕愈合试验检测的统计直方图。与对照组比较，*P<0.05

2.2 Transwell实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动性的影响 不同浓度石榴皮鞣质作用于PC-3细胞48 h后，结果显示，在石榴皮鞣质浓度分别为25、50、100 μg/ml时，PC-3细胞的穿膜细胞数分别为322.00±5.57、187.67±3.51、160.67±5.69，与对照组相比，EGCG作用48 h后能明显降低PC-3细胞的趋化运动性(P<0.05)，且随着石榴皮鞣质浓度的逐渐增加，其抑制PC-3细胞趋化运动性也逐渐增强。见图2。

2.3 Transwell小室侵袭实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响 同浓度石榴皮鞣质作用于PC-3细胞48 h后，结果显示，在石榴皮鞣质浓度分别为25、50、100 μg/ml时，PC-3细胞的穿膜细胞数分别为130.00±5.57、81.67±3.51、68.67±5.69，与对照组相比，石榴皮鞣质作用48 h后能明显降低PC-3细胞的侵袭性(P<0.05)，且随着石榴皮鞣质浓度的逐渐增加，其抑制PC-3细胞侵袭性也逐渐增强。见图2。

图2 Transwell实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞运动能力的影响

注：A.Transwell实验检测对照组与石榴皮鞣质浓度分别为25、50、100 μg/ml时PC-3细胞穿膜细胞数的代表图，B.Transwell实验迁移实验的统计直方图。与对照组比较，*P<0.05

2.4 肺转移模型实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响 裸鼠的肺转移瘤模型试验结果显示，将BALB/C免疫缺陷鼠肺脏用石蜡包埋处理后，切片HE染色后显微镜下观察肺脏内的肿瘤有无转移灶并计数，结果显示，对照组细胞所形成的肺转移裸鼠明显多于石榴皮鞣质浓度分别为0、25、50、100 μg/ml时PC-3细胞组的肺转移裸鼠，肺转移率分别为 100%(6/6)、50%(3/6)、33.33%(2/6)、16.67%(1/6)(P<0.05)。见图4。

3 讨论

图3 Transwell实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响

注：A.Transwell实验检测对照组与石榴皮鞣质浓度分别为25、50、100 μg/ml时PC-3细胞穿膜细胞数的代表图，B.Transwell实验迁移实验的统计直方图。与对照组比较，*P<0.05

图4 肺转移模型实验检测石榴皮鞣质对PC-3细胞侵袭能力的影响

注：A.HE染色显示对照组细胞与石榴皮鞣质浓度分别为25、50、100 μg/ml时PC-3细胞各组裸鼠肺转移的典型染色图片(100×)，B.各组裸鼠肺转移数量统计柱状图

前列腺癌是较常见的发生在老年男性患者的恶性肿瘤，在美国占40岁以上男性癌症死亡原因的第2位[5]，在我国部分城市前列腺癌的发病率正在逐年增长[6]。前列腺癌临床分期不同其治疗也有差异，根治性前列腺癌切除术因其疗效确切，是治疗早期前列腺癌的金标准[7]，但临床上大部分前列腺癌患者就诊时已错过手术时机。

石榴皮中的主要活性成分石榴皮鞣质，具有抗皮肤癌[8]、乳腺癌[9]作用。本文选用的PC-3细胞株属于激素非依赖性前列腺癌细胞，具有高侵袭性，恶性程度高。石榴皮鞣质是从石榴皮中提取的一类有效活性物质，本研究应用不同浓度石榴皮鞣质作用于PC-3细胞，观察其对肿瘤细胞侵袭性的影响。

划痕愈合实验检测结果显示，石榴皮鞣质对前列腺癌细胞运动具有抑制作用。Transwell小室实验(无基质胶)检测实验结果显示，与对照组相比，石榴皮鞣质作用48 h后能明显降低PC-3细胞的趋化运动性，且随着石榴皮鞣质浓度的逐渐增加，其抑制PC-3细胞趋化运动性也逐渐增强。Transwell小室实验(有基质胶)检测结果显示，与对照组相比，石榴皮鞣质作用48 h后，能明显降低PC-3细胞的侵袭性，且随着石榴皮鞣质浓度的逐渐增加，其抑制PC-3细胞侵袭性也逐渐增强。

此外，本研究中BALB/C免疫缺陷鼠肺脏用HE染色后，在显微镜下观察肺脏内的肿瘤有无转移灶并计数，结果显示，对照组细胞形成的肺转移裸鼠明显多于石榴皮鞣质PC-3细胞组的肺转移裸鼠，与对照组相比，随着石榴皮鞣质浓度增加，PC-3细胞所形成的肺转移瘤也逐渐减少。

综上，本研究结果表明，石榴皮鞣质可以有效抑制PC-3细胞的侵袭性，为开发与研究能够抑制激素非依赖性前列腺癌侵袭性的药物提供了理论依据。