趋化素样因子超家族成员6的研究进展①

韦 俐 蒋敬庭 (苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心，江苏省肿瘤免疫治疗工程技术研究中心，苏州大学细胞治疗研究院，常州 213003)

含CKLF样MARVEL跨膜结构域基因(CKLF-like MARVEL transmembrane domain-containing,CMTM)是一个新的蛋白质家族，包括八个CMTMs基因(CMTM1-CMTM8)和一个趋化因子样因子基因(chemokine-like factor,CKLF)[1]。八个CMTMs基因由于含有CKLF样的跨膜结构域，所以具有倾向于趋化因子的功能而广泛参与体内的信号转导、细胞增殖、细胞迁移和细胞活化等生命过程。尤其是在人源的多种肿瘤中都已发现有CMTMs家族蛋白的参与。2017年发表于Nature上两篇关于CMTM4蛋白和CMTM6蛋白(主要是CMTM6蛋白)介导程序性死亡受体1配体(PD-L1)独特保护机制的报道使得CMTM6分子得到广泛关注[2,3]。尽管有关CMTM6功能和作用的研究还比较少，但是CMTM6在多种肿瘤以及肿瘤微环境中的高表达表明了CMTM6存在作为潜在研究靶点的价值。

1 CMTM6的促癌作用机制

CMTM6基因属于CMTMs家族，位于3号染色体p22区。CMTM6蛋白由183个氨基酸组成，分子为20.4 kD。与该家族其他成员一样，CMTM6蛋白是具有MARVEL样结构域的3型跨膜蛋白，包含至少三个跨膜螺旋结构，主要定位于细胞质膜上，在细胞质内或中间丝上也都有定位[4]。有研究指出，CMTM6的缺失会降低肿瘤特异性T细胞活性并引起肿瘤“免疫逃逸”，从而显示CMTM6基因可能是肿瘤发生中的抑癌基因[5]。但是，Li等[6]在HeLa宫颈癌细胞中过表达CMTM6蛋白后发现并没有影响癌细胞的增殖情况，表明CMTM6可能不具有肿瘤抑制功能。并且更多的研究表明，CMTM6 在结肠癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、黑素瘤等多种肿瘤中都有高表达现象[3,6-9]，并且与“促癌基因”PD-L1的表达具有一致性。PD-L1的高表达水平可以通过PD-1/PD-L1途径抑制效应T细胞的活性使肿瘤细胞获得“免疫逃逸”，而CMTM6的高表达在黑素瘤中正是维持高PD-L1蛋白池含量的关键调节分子[3,10,11]。因此，越来越多的数据倾向于认为CMTM6在肿瘤中具有促进肿瘤的作用，当然这种作用可能是直接影响肿瘤细胞的增殖，也有可能是通过调节肿瘤微环境来实现的[7,12,13]。在临床上高表达的CMTM6也与肿瘤预后不良相关[14]。

尽管在大多数的肿瘤组织或者肿瘤细胞系中CMTM6都是高表达的，但是在某些食管肿瘤中，初步研究却发现CMTM6的mRNA和蛋白水平都是下调的，这提示CMTM6可能在不同的肿瘤中具有不同表达现象以及不同的调节作用[6]。

2 CMTM6介导的PD-L1稳定性

PD-1/PD-L1作为人体中最重要的免疫检查点分子之一，靶向PD-1的单抗制剂已经成为治疗PD-L1高表达的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的一线临床用药[11,15]。事实上，PD-L1在多种晚期高危肿瘤都具有高表达现象，同样在这些肿瘤中也存在CMTM6蛋白的高表达现象。因为MARVEL结构蛋白具有调节跨膜运输和蛋白分泌的能力，具有MARVEL结构的CMTM6同样在蛋白质稳定和再循环中起作用[4]。Marian L.Burr等的研究发现，在用35S-半胱氨酸/蛋氨酸进行脉冲标记的CMTM6敲除细胞中，CMTM6基因的缺失会导致PD-L1蛋白的迅速降解并降低其在肿瘤细胞表面的表达，但是没有损害PD-L1在内质网中的运输及其在高尔基体中的交换。进一步研究发现，CMTM6与PD-L1的特异性结合可以维持PD-L1/CMTM6蛋白复合体在内含体中的再循环而保护PD-L1蛋白不被溶酶体识别并降解，维持PD-L1蛋白的高表达。更为关键的是，这种保护机制不仅对肿瘤细胞中固有的PD-L1存在作用，对干扰素(IFNγ)诱导的PD-L1同样存在作用。而干扰素诱导PD-L1表达增加是通过激活转录因子增加PD-L1 mRNA来促进PD-L1蛋白表达的，CMTM6基因的缺失并没有影响肿瘤细胞中固有的PD-L1 mRNA水平，也没有影响IFNγ诱导的PD-L1 mRNA水平[2]。

在另一项研究中，Mezzadra等[3]发现CMTM6可增加PD-L1蛋白池，而不会影响PD-L1基因的转录水平。进一步研究表明，在CMTM6缺失的细胞中，PD-L1的泛素化修饰会增加，而被泛素化标记的底物蛋白会被26S蛋白酶体识别而有可能经历溶酶体降解途径。CMTM6与E3泛素连接酶STUB1可能存在某种调节机制，在肿瘤细胞中抑制了PD-L1的泛素化修饰，从而阻止了高表达的PD-L1被降解。事实上，除了CMTM6，CMTM家族的另一个成员CMTM4同样具有调节PD-L1蛋白稳定性的作用。CMTM4与CMTM6具有55%的序列相似性。当CMTM6缺失时CMTM4会被作为“备胎”启用来维持PD-L1的稳定性，只是CMTM4的调节效率要低于CMTM6[4]。

CMTM6对PD-L1特异性的保护机制可能是众多肿瘤组织和细胞系中同时存在高表达的重要原因，而PD-L1阳性表达的肿瘤细胞或者抗原呈递细胞一定程度上意味着肿瘤微环境中T细胞免疫衰竭[16,17]。相关研究也表明，CMTM6的敲除能极大地降低对肿瘤特异性T细胞活性的抑制[5]。总之，CMTM6介导的PD-L1内含体再循环机制有效保护PD-L1避免被泛素化-溶酶体降解途径降解，从而使肿瘤细胞和部分抗原呈递细胞表面的PD-L1处于高表达水平，进一步增加肿瘤细胞的获得性免疫逃逸。因此，CMTM6与众多肿瘤的发生和发展都存在着关联。

3 CMTM6/PD-L1在DNA损伤中的作用

细胞对DNA损伤反应同时受到蛋白网络的调控，这其中转导蛋白ATM激酶和效应蛋白WEE1核激酶起着重要调控作用[18]。有研究表明，WEE1和ATM都可以促进DNA修复来维持肿瘤进展中的细胞存活[19]。相反，在许多具有DNA损伤反应的肿瘤中，抑制ATM和WEE1可以消除DNA损伤后的修复，起到协同杀伤肿瘤的效果[19-22]。然而，肿瘤中DNA损伤后会上调PD-L1的表达，但是在抑制ATM或WEE1后，CMTM6的表达显著下降并且PD-L1和CMTM6的相互作用也显著降低[23,24]。因为CMTM6可以促进PD-L1内含体再循环保护PD-L1不被溶酶体降解，另外有研究表明HIP1R能够促进递送PD-L1到溶酶体中[25]。因此，在肿瘤进程中 WEE1或者ATM可能促进了CMTM6翻译过程表达并同HIP1R竞争与PD-L1的结合，降低PD-L1的溶酶体递送，但是更有可能是促进了CMTM6基因组的修复，进而维持了肿瘤中CMTM6的高表达[23]。

4 CMTM6/PD-L1在基因组稳定性中的意义

Tu等[26]的研究发现细胞内PD-L1可以作为RNA结合蛋白并调节NBS1，BRCA1和其他DNA损伤相关基因的mRNA的稳定性。PD-L1通过与RNA外泌体竞争，保护目标RNA免受降解，增加细胞对DNA损伤的抵抗力。这说明，PD-L1除了发挥PD-1/PD-L1轴的“免疫刹车”效用，还存在其他重要的调控作用。事实上，PD-L1可以调节整改基因组RNA稳定性，但是在消除CMTM6与PD-L1之间的相互作用时，PD-L1的稳定性被破坏，同时PD-L1与靶基因的RNA的结合也被破坏，导致靶RNA的降解[26]。CMTM6/PD-L1对基因组RNA的稳定性调节也间接证明CMTM6/PD-L1对肿瘤发生及肿瘤细胞本身的生存状态有着更重要的调节作用。

5 CMTM6与肿瘤的关系

随着研究的不断深入，人们发现CMTM6与多种肿瘤的发生发展存在密切的关系，见表1。

5.1CMTM6与NSCLC 靶向PD-1的单抗制剂Pembrolizumab已经成为治疗PD-L1高表达的晚期非小细胞肺癌患者的一线临床用药[11,15]。而CMTM6介导的PD-L1的保护机制也同样存在于非小细胞肺癌细胞中[3]。Riman等[13]发现在438个NSCLC临床患者组织中70%的肿瘤和肿瘤基质中检测到CMTM6的表达，并且CMTM6的表达与临床特征或EGFR/KRAS突变状态无关，但是与T细胞浸润之间存在相关性。这说明在NSCLC中CMTM6可能与淋巴细胞的免疫活性有关，而与肿瘤基因表达的变化无关，也就是说CMTM6可能依然只是发挥着特异性调节PD-L1稳定性的作用。虽然在肺癌患者中CMTM6与PD-L1存在相关性，但是他们在肿瘤基质中的相关性要高于在肿瘤细胞中，并且CMTM6与PD-L1共表达的患者在接受免疫治疗后会获得更长的总生存期[3,27]。同样，Yong等[8]在晚期难治性NSCLC患者中也发现CMTM6表达与PD-L1表达呈正相关，并且这种相关性是蛋白水平和基因水平上同时存在的。在接受PD-1抑制剂治疗的患者中，对PD-1抑制剂有应答的患者具有较高的CMTM6表达，而PD-L1表达与这种响应性则无关。因为PD-1抑制剂主要是阻断T细胞表面的PD-1受体，而CMTM6对PD-1并没有特异性作用[11,28]。这提示，在PD-1抑制剂恢复的肿瘤中T细胞杀伤效应时肿瘤及肿瘤微环境中存在着某种机制去促进CMTM6的表达以恢复PD-L1介导的免疫抑制作用。这可能和PD-L1恢复基因组RNA稳定有关，其中CMTM6 的RNA 本身有可能就是PD-L1的靶点[26]。

5.2CMTM6与肝癌 表观遗传基因调控与多种肿瘤的发生有关，DNA甲基化是主要的表观遗传修饰之一并在控制基因表达中发挥作用，而启动子鸟嘌呤残基CpG岛基因座上的异常甲基化常常会导致活跃基因失活或加剧失活基因的沉默[29]。在肝癌以及新生肝癌中CMTM6的DNA甲基化也参与了肝癌的发生和发展过程。Atsunori等[29]研究发现在用丁基哌啶丁酶(PBO)诱导小鼠新生病灶区周围的非瘤肝细胞中CMTM6的DNA启动子区域的甲基化水平有轻微增加的趋势，但是CMTM6的翻译水平是下降的。相反的是，在PBO诱导的肝细胞癌增生病灶的CMTM6的甲基化并没有改变。这说明，新生肿瘤病灶区与周围非癌肝细胞中CMTM6 DNA甲基化的改变可能是诱导正常肝细胞向癌细胞转变的重要调节过程。

表1 CMTM6在不同肿瘤中的表达意义及作用机制

Tab.1 Expression significance and mechanism of CMTM6 in different tumors

肿瘤类型表达意义作用机制参考文献非小细胞肺癌肿瘤和肿瘤周围基质中表达,响应PD-1/PD-L1的免疫治疗通过PD-L1介导免疫细胞功能[3,8,13,27,28]肝癌参与肝癌的发生和发展,诱导正常细胞癌变,响应PD-L1 CMTM6的DNA甲基化[5,29,30]胶质瘤影响胶质瘤患者的生存预后,并影响GBM细胞增殖、侵袭等功能介导巨噬细胞和T细胞功能,CMTM6直接影响GBM细胞功能[9,11,14,33]乳腺癌影响患者无转移生存期和PD-L1的预后价值稳定PD-L1表达[4]胰腺癌影响患者无转移生存期和PD-L1的预后价值稳定PD-L1表达[4]结肠癌响应环状RNA(CDR1-AS)对PD-L1的调控稳定PD-L1表达[7]

相反，Zhu等[5]在75对肝细胞癌和邻近肝肿瘤组织的临床标本中也发现CMTM6在肝癌组织中的阳性表达水平明显低于相邻的非肿瘤组织，并且CMTM6的下调与肝细胞癌的转移以及与患者的预后有关。这样的临床统计结果也与其他肿瘤中CMTM6的高表达现象相反。这提示我们，CMTM6可能在肿瘤发生阶段和肿瘤发展阶段所发挥的作用不同。研究表明，在肝癌的早期阶段肿瘤的抑癌基因甲基化程度是呈现增加趋势的，而表现出抑癌基因翻译水平降低，抑癌效果降低[30]。也就是说，CMTM6有可能在正常组织和肝细胞癌变发生阶段是表现出抑癌作用的，但是在肿瘤发展阶段又发挥了促癌作用。而CMTM6两种不同情况的研究结果也可能和PD-L1的表达密切相关。正如上文所提的，PD-L1具有调节基因组稳定性的能力，而在恶性肿瘤中PD-L1普遍具有高表达水平。因此，CMTM6在肝癌发生、发展甚至与恶化程度可能都有直接的关联。

5.3CMTM6 与脑胶质瘤 胶质母细胞瘤(GBM)是常见的恶性肿瘤,具有侵略性的生物行为和对治疗的抵抗性[11]。而PD-L1的表达与肿瘤的恶性程度密切相关，所以多项研究也表明PD-L1在GBM细胞中高表达[31,32]。由于PD-L1的稳定性需要CMTM6介导的保护作用，理论上CMTM6在GBM细胞中应处于高表达。事实上，有研究发现CMTM6和胶质瘤的病理级别密切相关，更重要的是，CMTM6高表达与胶质瘤患者的生存预后也存在一定关系[14]。本课题组研究发现，CMTM6高表达患者的五年累积总生存率和无病生存率较低表达患者均明显下降。该研究还认为，CMTM6与胶质瘤的强相关性除了与CMTM6对PD-1/PD-L1轴的调节有关外，还与CMTM6的激活肿瘤相关巨噬细胞和功能失调的T细胞有关[14]。Gabriele等研究发现CMTM6基因本身就可以调节巨噬细胞，在沉默CMTM6基因后巨噬细胞摄取低密度脂蛋白(LDL)的能力下降[33]。氧化型LDL可以诱导正常巨噬细胞向M2型极化的巨噬细胞转化，M2极化巨噬细胞正是维持胶质瘤微环境并抑制T细胞活化的重要负性调节细胞[11]。此外，CMTM6对胶质瘤细胞本身也具有直接调控作用。Delic等[9]发现CMTM6 在脑胶质母细胞瘤中被上调，并且在沉默CMTM6基因后胶质瘤细胞U251的细胞增殖显著受到抑制。本课题组也发现在胶质瘤细胞U87和U251中CMTM6的mRNA水平和蛋白水平都显著增加，并且在沉默CMTM6基因后不仅显著抑制细胞的增殖，还显著降低胶质瘤细胞的迁移和侵袭。所以，在胶质瘤中CMTM6可能还发挥与其趋化因子功能相关的作用，而不仅仅只是保护PD-L1不被泛素-溶酶体途径降解。

5.4CMTM6与其他肿瘤 在三阴乳腺癌中，CMTM6和PD-L1具有异常表达现象，但是高表达CMTM6比低表达组拥有更长的无转移生存期[4]，并且CMTM6表达能够提高PD-L1的预后价值，即高表达PD-L1同时高表达CMTM6的患者拥有良好的预后，五年无转移生存率占到70%。但是高表达PD-L1同时低表达CMTM6的患者五年无转移生成率占到57%，而二者都低表达的患者五年无转移生存率只有40%。在胰腺癌中也同样观察到CMTM6相似的异常表达和预后价值，但是在胰腺癌中CMTM6高表达与较短的总生存期有关，CMTM6低表达的胰腺癌患者两年期总生存率占比49%，远高于高表达的34%[4]。在结肠癌中，环状RNA(CDR1-AS)表达可以显著上调CMTM4和CMTM6的表达，因此增加细胞表面PD-L1蛋白的表达[7]。但在某些食管肿瘤中，CMTM6的mRNA和蛋白水平却被发现是下调的[6]。

6 展望

CMTM6介导的PD-L1的内含体循环保护揭示了PD-L1调节的新机制，并且CMTM6分子也具备影响PD-1/PD-L1“免疫检查点”的能力，从而表现出调控T细胞活化实现肿瘤免疫治疗的潜在价值。尽管在胶质瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤等肿瘤细胞中CMTM6表现出高表达现象，但是在肝癌以及部分食管癌中也存在低表达的现象，这种差异表达可能和研究对象中肿瘤的发展及恶性等级相关。虽然至今并没有研究揭示CMTM6本身表达的受调控机制，但CMTM6在多种肿瘤中表现出与肿瘤恶性程度相关的发现让我们相信，CMTM6在肿瘤不同阶段可能受到了某种适应性调节机制的调节，而这种机制可能和CMTM6/PD-L1的基因组调节作用以及CMTM6基因的表观遗传调控有关，并且这两种调节机制可能不仅仅存在于肿瘤细胞中。因此，深入探索CMTM6在肿瘤发生和发展中介导的受调控机制将会为肿瘤免疫治疗提供新策略。